Реакции с использованием меченых антител или антигенов

Реакция иммунофлюоресценции – РИФ (метод Кунса)

Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ используется как метод экспресс-диагностики для выявления антигена в исследуемом материале от больных. Метод состоит в обработке фиксированного на стекле материала, содержащего искомый (неизвестный) антиген, гомологичной иммунной сывороткой (известные АТ), меченной флюорохромом. Метод основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. В положительных случаях по периферии объекта (бактериальной клетки) появляется светящаяся кайма зеленого цвета. Недостатком метода является необходимость получения большого количества стандартных люминесцирующих сывороток против различных микроорганизмов.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) основана на применении антиглобулиновой (антивидовой) сыворотки, меченной флюорохромом. Она ставится в два этапа. На первом этапе фиксированный антиген обрабатывают обычной иммунной сывороткой. На втором этапе к прореагировавшему иммунному комплексу добавляют люминесцирующую сыворотку против глобулинов того вида животного (кролика), сыворотка которого была использована на первом этапе. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают и учитывают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Иммуноферментный анализ (ИФА) – это иммунологическая реакция специфического взаимодействия антигена и антитела, в которой в качестве индикатора используются молекулы фермента (пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и др.). В основе этого теста лежит способность маркерного фермента расщеплять субстрат – ортофенилендиамин для пероксидазы хрена или паранитрофенилфосфат для щелочной фосфатазы и вызывать изменение цвета реактивной среды. Названные ферменты обладают уникальным свойством модифицировать одновременно большое количество молекул субстрата, что приводит к усилению чувствительности иммунологической реакции.

Субстрат/хромоген добавляют в смесь после соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Маркерным ферментом могут быть помечены антимикробные или антивидовые антитела, что предполагает использование разных методик проведения анализа: твердофазный ИФА, сэндвич-метод ИФА и др. Компоненты иммунного комплекса выявляются с помощью специального принтера – ридера типа «мультискан» и др.

Твердофазный ИФА – наиболее распространенный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшет из полистирола.

При определении антител в лунки планшет с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат (хромоген) для фермента.

Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена.

Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента.

Конкурентный вариант ИФА: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест – искомые антитела и меченые антитела конкурируют друг с другом за антигены.

ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях – 10¹⁰–10¹² г/л.

Радиоиммунологический анализ (РИА) основан на выявлении иммунных комплексов Аг-АТ с помощью радиоактивной метки, введенной в состав одного из компонентов реакции – антигена или антитела. После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Это качественный и количественный метод определения одного из участников иммунного комплекса.

При твердофазном варианте РИА один из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола.

Другой вариант метода – конкурентный РИА: искомый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант используют для определения количества антигена в исследуемом материале.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях – 10^-12–10^-15 г/л. Метод представляет определенную экологическую опасность. Чувствительность РИА на порядок превышает чувствительность ИФА.

Иммуноблоттинг (ИБ)

Иммуноблоттинг (ИБ) – высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.

Антигены разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг – от англ. blot, пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА (или РИА). Фирмы выпускают полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся АТ больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченую ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больного + антитело против Ig человека выявляют добавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску под действием фермента.

ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.