Характеристика культур клеток

Популяцию клеток тканей, которая способна развиваться и существовать in vitro (в пробирке), называют культурой клеток.

Впервые методику приготовления культур клеток предложили Дульбекко и Фогт в 1952 г. В настоящее время в практику вирусологических исследований внедрены несколько видов культур клеток:

1) Первичные трансинизированные – популяции клеток, полученные из тканей, взятых непосредственно из организма. Для приготовления первичных культур клеток используют органы (почки, тимус, легкие, тестикулы (яички) эмбрионов или новорожденных животных). Хорошо известна культура куриные фибробласты, эпителий и мышцы куриного эмбриона, образующие слой в толщину клетки на поверхности стекла. Почка эмбриона теленка, поросенка представляет почечный эпителий, выросший и прикрепленный к стеклу. Первичные культуры характеризуют как монослойные и прикрепленные.

В развитии популяции клеток установлено 4 фазы роста: 1)адаптации 2)логарифмического роста 3)стационарная 4)старение.

2) Субкультуры получают из первичных культур снятием со стекла и ресуспензированием в новой питательной среде. Они выдерживают 3-5 переливаний. Субкультуры получены из всех первичных, кроме куриных фибробластов.

3) Полуперевиваемые диплоидные – морфологически однородная стабилизированная популяция клеток, имеющая ограниченный срок жизни с тремя фазами роста, сохраняющая кариотип, свободная от контаминантов и не обладающая онкогенной и туморогенной активностью при трансплантации хомячкам. Впервые диплоидную клеток ВНК-21 (почка хомяка) получили Хейфлик, Мурхед в 1961 г. Полуперевиваемые культуры клеток получены из тканей эмбрионов (почка теленка, свиньи). Полуперевиваемые культуры клеток могут быть жизнеспособными в течение 10-12 дней, если переливать еженедельно – живут 4 недели, выдерживая до 50 переливаний.

4) Перевиваемые культуры клеток – популяции клеток тканей, способные к размножению in vitro неограниченное время. Перевиваемые культуры клеток специально получены в результате селекции единичных клеток эмбриональной ткани и злокачественных опухолей. Известны переливаемые культуры клеток из злокачественных опухолей Hella – карцинома, Hep-3 – лимфоидная карцинома, КВ – карционома. В ветеринарной вирусологии широко применяют переливаемые культуры клеток из эмбриональных тканей – СПЭВ (перевиваемая почка эмбриона свиньи), ППЭС (перевиваемая почка эмбриона свиньи), ППТ (перевиваемая почка теленка), ППО (перевиваемая почка овцы), ТR (трахея коровы), L (мышиные фибробласты), COLS (сердце обезьяны). Современные перевиваемые культуры клеток ПГ80, Т1 (почка теленка), ЛЭВ (легкое эмбриона коровы), WERO (почка зеленой мартышки), КСТ (коронарные сосуды теленка).

5) Суспензионные культуры клеток – популяция клеток, не прикрепленная к стенкам пробирок, находятся в свободном состоянии.

Многие перевиваемые культуры клеток превращены в суспензионные (ВНК21, Hep-2, МДВК). Лучшие накопления суспензионных клеток получают при использовании носителей: сефадекс, силикагель, фитолат. Культуры клеток при длительном использовании консервируют: +4⁰С в течение 1-6 недель; -78⁰С – сухой лед; -196⁰С в жидком азоте. Консервирование включает: снятие клеток, суспензирование в питательной среде с добавлением 10-40 % сыворотки, 10 % ДНСО, антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, мономицин, гентамицин) в дозе 100 мкг/мл и больше. Расфасовку в ампулы и замораживание. Ампулы с замороженными клетками можно транспортировать при 40⁰С, живые 7-8 дней. Для снятия клеток со стекла используют раствор 0,25 % трипсина на фосфатном буфере, раствор Версена (натриевая соль диаминтетрауксусной кислоты на 0,02 % растворе Хенкса). Растворы Хенкса, Эрла содержат соли, глюкозу, индикатор на бидистиллированной воде. Восстанавливают размораживаем, затем вносят питательную среду, которую на другой день меняют.

Выращивают культуры клеток на питательных средах естественных и искусственных, синтетических и полусинтетических.

Естественные питательные среды – это смесь раствора Хенкса, Эрла и сыворотки крови, эмбрионального экстракта (используют редко).

Искусственные полусинтетические – ферментативные гидролизаты, казеиновый гемогидролизат, аминопептид, лактоальбумины (в количестве 2,5-5 %).

Искусственные синтетические: среда 199 (содержит 60 компонентов), среда Игла.

Указанные среды имеют рН 7,2-7,4. Содержат индикатор феноловый красный и имеют красный цвет. При снижении рН желтеют. При повышении приобретают красно-малиновый оттенок.

По назначению питательные все питательные среды для культур клеток подразделяют на ростовые – обеспечивают жизнь, размножение клеток, содержат сыворотку крови (телят, эмбриональную КРС); поддерживающие – обеспечивают существование клеток после заражения вирусом.

Типы взаимодействия вирусов с клеткой.

Известно 7 типов взаимодействия вирусов с клетками.

1)Различные патологические изменения от угнетения функциональной активности до повреждения структур клеток. Впервые повреждение структур клеток обнаружил Хуан, Эндерс в 1943 г. Такое действие вируса они называли цитопатогенным (ЦПД). Современное название – цитопатический эффект ЦПЭ. Сущность ЦПД заключается в угнетении митоза, влиянии на хромосомный аппарат, лизисе клеток, отчего в культурах клеток возникает феномен бляшкообразования. Влияние ЦПД вирусов на митоз макро-, микроскопически проявляется появлением округлых клеток, образованием симпластов (гигантских многоядерных клеток), образование синтициев (конгломератов в цитоплазме с многочисленными ядрами), что происходит в результате массовой гибели клеток. При влиянии на генетический аппарат происходит сморщивание ядра, образование телец-включений.

2) Интерференция – подавление вируса в клетке.

3)Накопление вируса без повреждения клетки. Например, вирус классической чумы свиней.

4) Пролиферация – бурное деление клеток, инфицируемых вирусом. Клетки активно размножаются и содержат в геноме вирус.

5) Изменение метаболизма клеток с накоплением кислых продуктов в клетке. Такой тип взаимодействия у вируса полиомиелита человека. Вспышка полиомиелита в СССР 1951-1952 гг. Был создан институт полиомиелита во Внуково. Сейчас – массовая вакцинация. У животных вирус полиомиелита не циркулирует.

6) Адсорбция эритроцита клетками, которые инфицированы вирусами. Вирус ПГ3 (парагрипп). Обнаруживают данный феномен в реакции гемадсорбции.

7) Агглютинация (склеивание) эритроцитов культуральной жидкостью. Вирус НБ – болезнь Ньюкасла.

ОСНОВЫ ГЕНЕТИКИ ВИРУСОВ

Материальная основа генетической информации вирусов

Вирусами характеризуются двумя свойствами:

1) Наследственность – свойство обеспечивать преемственность поколений.

2) Изменчивость – способность изменять генетический состав.

Материальной основой генетической информации у вирусов является геном – последовательность нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты. Различают цельный геном и фрагментированный, когда каждый фрагмент нуклеиновой кислоты – ген. Количество генов у вирусов от 3 до 30. В составе вирусных генов есть экзоны – смысловые кодирующие фрагменты, и интроны – не кодирующие участки гены.

У большинства вирусов геном гаплоидный (одинарный). У некоторых, например ретровирусы, – диплоидный (двойной).

Вирусы подвержены изменчивости в связи: 1) с высокой численностью образующейся популяции; 2) быстрой сменой поколений; 3) гаплоидностью генома, его малой емкостью (3-30 генов); 4) непрерывностью репродукции.

Все признаки вируса, кодированные в генах, называют маркёрами. Различают видовые маркёры (биологические свойства вида) и внутриштаммовые маркёры.

Основу наследственных изменений у вируса составляют два процесса – мутации и рекомбинации.

Характеристика мутаций

Мутации – изменения последовательности нуклеотидов в геноме, ведущие к изменению биологических свойств, которые передаются по наследству.

По механизму действия мутации происходят в результате делеции (выпадения одного или нескольких нуклеотидов), трансверсии (взаимозамены пуриновых и пиримидиновых оснований нуклеиновой кислоты в результате действия каких-то ферментов), транзиции (замена одного пуринового или пиримидинового основания на другое, например цитозин меняется на урацил).

По локализации изменения в геноме бывают точечными в одном или двух нуклеотидах; обширными (аберрации) – замена значительного участка генома.

По обратимости известны необратимые, прямые мутации; образующиеся мутанты начинают широко распространяться, могут даже вытеснить дикие виды, полевые виды, от которых они произошли; обратимые мутации (истинные реверсии) – когда происходит восстановление поврежденного генома.

По происхождению мутации бывают спонтанные в результате перегруппировки оснований нуклеиновой кислоты, из-за ошибок ферментов ДНК- и РНК-полимеразы; индуцированные – происходят под действием химических, физических и биологических факторов. Индуцированные мутации используют для получения вакцинных штаммов вируса. Химическими мутагенами считают азотистые основания, алкилирующие соединения, азотистую кислоту, гидроксиламин. К физическим мутагенам относят УФЛ, повышение температуры, изменения рН. К биологическим мутагенам относят пребывание вируса в организме слабо восприимчивого или не восприимчивого животного, в культурах клеток из гетерогенных тканей, в КЭ. В результате многочисленных пассажей происходит изменение генного состава, а мутанты стабильно и окончательно теряют вирулентность.

Рекомбинации вирусов

Рекомбинация, или обмен генами между вирусами, может быть межгенная (обмен целыми генами), а также внутригенной (обмен участками генов).

Рекомбинацию вирусов называют гибридизация.

Она проявляется множественной реактивацией – восстановлением поврежденного генома путем добавления его генами с помощью обмена.

Кросс-реактивация – восстановление активности инактивированного (убитого) вируса неповрежденным геномом другого вируса, а также в результате взаимодействия геномов двух убитых вирусов.

Пересортировка генов, когда вирусы с фрагментированным геномом образуют группировки генов, обеспечивающих повышенную жизнеспособность вируса, – их называют реассортанты.

Гетерозиготность. При совместной репродукции разных видов вируса образуются объекты, содержащие полный собственный геном и часть генома другого вируса, иди полностью геном другого вируса, – такие вирусы называют гетерозиготными.

Комплементация – объединение генов синтеза ранних вирусных белков у поврежденных вирусов. В результате дефективные вирусы, не способные к репродукции по одиночке, начинают проходить полный цикл репродукции.

Негенетическая реактивация, когда вирус с денатурированными белками способен к репродукции за счет активности ферментов другого вируса.

Вирусам свойственны и не генетические взаимодействия:

1. Фенотипическое смешивание – при совместной репродукции разных видов образуются вирусы с собственным геномом, но белками других вирусов. По антигенным свойствам такие вирусы соответствуют виду и другим видам.

2. Интерфирирубщее взаимодействие обозначает состояние невосприимчивости клетки к вторичному заражению; обусловлено угнетением адсорбции и трансляции.

ПРОТИВОВИРУСНЫЙ ИММУНИТЕТ. ПРОТИВОВИРУСНЫЕ СРЕДСТВА. ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИЕ ПРЕПАРАТЫ.

Противовирусное действие показателей естественной резистентности (ЕР)

Неспецифическая противовирусная резистентность обусловлена отсутствием в клетках организма рецепторов для взаимодействия с вирусом и условий, необходимых для культивирования вирусов в клетках, а также ингибиторов вирусов (угнетения вирусов).

Репродукции вирусов препятствуют общефизиологические показатели: кожно-слизистый барьер (механическая преграда), муциновый слой слизистых (препятствует адсорбции), повышение температуры тела (инактивирует вирионы, а также подавляет репродукцию внутри клеток), снижение рН внутри клеток (препятствует репродукции), выделение вируса почками, кишечником снижает его титр в организме.

Клеточные факторы имеют ограниченное противовирусное действие.

Клетки СМФ (системы мононуклеарных фагоцитов) распознают чужеродность вируса.

ЕК (естественные киллеры) могут лизировать клетки, содержащие вирус. Активность ЕК приводит к понижению титра вируса в организме, однако главная функция ЕК – уничтожение опухолевых клеток, разрушение метастаз в организме (цитолиз – разрушение клеток).

Гуморальные факторы ЕР имеют существенной профилактическое значением при вирусных инфекциях.

Главный фактор – система ИФН, которая включает синтез и содержание интерферонов в организме, α-интерферон активно уничтожает вирионы за пределами клетки. Интерферон также подавляет синтез компонентов вирусов клетки.

Фракция комплемента С₃ усиливает нейтрализацию вирионов Jg (антителами), лизирует клетки, содержащие вирус, т.е. снижает активность репродукции, – они превращаются в вирионы, которые нейтрализуются ИФН и Jg.

Фракция комплемента С₁ инактивирует вирионы ретровирусов.

Механизм противовирусного иммунитета

Каждый вирус представляет сложную смесь антигенов белковой природы, способная вызвать иммунный ответ. Вирусы – хорошие антигены. Против них активно образуются Jg.

В составе вируса содержатся как Т-зависимые антигены, нуждающиеся в распознании с помощью Т-хелперов, так и Т-независимые, способные запускать механизм синтеза Jg и активизировать В-лимфоциты.

Противовирусный иммунитет начинается с распознания антигенов вируса вспомогательными клетками иммунной системы (клеток АПК (вспомогательные, антиген-презентирующие клетки): макрофаги, клетки Лангерганса кожи и поджелудочной железы, вуалевые (интердигидальные) клетки лимфоузлов, дендритные клетки костного мозга. Вспомогательные клетки в ответ на антигенное раздражение секретируют медиаторы, в первую очередь интерлейкин-1 (ИЛ-1). Он активизирует пролиферацию (размножение) и дифференциацию Т-клеток, начинают образовываться Т-хелперы, которые необходимы для распознавания Т-зависимых антигенов, и Т_ц-клетки (цитотоксические клетки), способные лизировать клетки, содержащие вирусы. Тц-клетки очень активные при отторжении ткани, а их высокий титр при вирусных заболеваниях может вызвать повреждение внутренних органов. Пролиферацию Тц-клеток активируют интерлейкин-2 и интерферон. ИЛ-1 активизирует В-клетки, которые секретируют Jg.

Против вирусов образуются Jg A, Jg G, Jg M. Jg нейтрализуют вирионы, участвуют в цитолизе клеток-мишеней совместно с С₃-интерфероном.

При вирусных заболеваниях образуются Т-эффекторы, медиаторы которых в частности ИЛ-2 и другие, тоже нейтрализуют вирионы.

Имеет место образование Т_гзт, а также Т-супрессоров (Тs), высокая активность которых формирует ИДС (иммунно-дефицитное состояние), например, при ВИЧ.

При вирусных заболеваниях очень мало образуется Jg E, которые при взаимодействии с тучными клетками образуют медиаторы воспаления.

Jg A работают на поверхности слизистых, нейтрализуют вирионы, резко понижают титр вируса в организме. Jg G и Jg M циркулируют в крови и нейтрализуют вирионы.

Иммунопатологическое действие вирусов

Противовирусный иммунитет может приводить к неблагоприятным последствиям, которые характеризуются как иммунопатологическое действие вирусов. Такой иммунный ответ вызывают возбудители. Такое действие может проявляться:

1) Накоплением иммунных комплексов (ИК, ЦИК – циркулирующий иммунный комплекс), большие количества которых накапливаются в органах, содержащих мембраны, а именно в почечных гломерулах, на синовиальных оболочках суставов, в хориоидальных сплетениях (паутинная сосудистая оболочка мозга), на стенках сосудов. Скопления ИКов, с которыми не могут справиться фагоциты, приводят к воспалению мест скопления ИКов – гломерулонефритам, арахноидитам (последствие чумы собак после длительной вирусемии), артритам.

2) Повреждением клеток тканей Т_ц-лимфоцитами. Чаще всего Т_ц-клетки повреждают печень. Клинически – гепатит, цирроз печени.

3) Формирование ИДС в результате высокой активности Т-супрессоров – имеет место при многих вирусных заболеваниях, выздоровевшие – чувствительны к бактериальным инфекциям.

Противовирусные средства

Цель химиотерапии вирусных болезней – создать препараты химического синтеза, подавляющие репродукцию, не повреждающие клетки и весь организм в целом.

Известные противовирусные средства оказывают на клетки токсическое действие. Известно 4 группы препаратов, подавляющих:

1) начальную стадию репродукции (адсорбцию)

2)средняя стадия (синтез компонентов)

3)заключительную стадию (сборку и выход вирусов)

4)репродукцию на разных стадиях

К ингибиторам начальных стадий относят: ремантадин (против гриппа, НБ, кори, краснухи), амантадин (грипп, краснуха, корь, НБ)

Ингибиторы синтеза вирусных компонентов (средняя стадия): азидотимидин (ВИЧ, онкогенные вирусы), ацикловир (герпес), рабавирин (грипп, ПГ-3), тамифлю (грипп), гамапрен (герпес-вирусная инфекция кошек – инфекционный ринотрахеит кошек).

Ингибиторы сборки и выхода: метисазан (оспа свиней, мазь применяется местно), гордокс (ВИЧ, онкогенные вирусы), контрикал (ВИЧ, онкогенные вирусы), апротинин (ВИЧ, онкогенные вирусы).

Препараты разных стадий репродукции: мегасин (герпес), хелипин (герпес), идуксуридин (герпес), хелепин (герпес), оксолин (грипп), арбидол (грипп), инговерин (грипп, ПМБ-вирусы, аденовирусы), фоспренил (ПМБ-вирусы, парвовирусы, кальцивирусы).

В химиотерапии применяют иммуностимулирующие препараты и их индукторы, а чаще всего с них начинают.

К иммуномодулирующим препаратам о тносят средства химической природы или биологического происхождения, способные модулировать (угнетать) или стимулировать иммунные реакции.

По происхождению они бывают гомологичные и гетерологичные.

К гомологичным относят вещества, вырабатываемые в организме, - их называют цитокины, обладают иммуностимулирующим действием. К ним относят интерфероны, интерлейкины, миелопептиды, вещества тимуса.

К гетерологичным иммуномодуляторам относят химические вещества: аскорбиновая кислота, левомизол (антигельминтное средство для человека; для кошек – смертельно), левокадин, гамавит (содержит нуклеинат натрия), циклоспарин А (ведущий отечественный иммунодепрессант, продуценты его – микроорганизмы, применяют перед пересадкой органов и тканей человеку).

По механизму действия иммуномодуляторы делят на вещества, влияющие на:

1)СМФ (система мононуклеарных фагоцитов) и продуцирование интерферона (α-интерфероны – нейтрофилы, γ-интерфероны – лейкоциты): гамавит, риботан

2)на Т- и В-систему: тимолин, тимоктин, продигиозан

3)Иммуномодуляторы – индукторы интерферона и активаторы Т-системы: аскорбиновая кислота, гентамицин