Схема постановки РДСК

------------------------T------------------T-------------------------

-----

¦ Компоненты реакции ¦ При массовом ¦ Для повторного

исследования ¦

¦ ¦ исследовании +--------------------T----

-----+

¦ +---------T--------+ пробирки для каждой

¦ контроль ¦

¦ ¦ пробирки ¦ контроль ¦ испытуемой

сыворотки ¦ гемолити- ¦

¦ ¦ с испыту- ¦ гемоли- +------T------T------

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

+ ческой ¦

¦ ¦ емыми сы- ¦ тической ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3

¦ системы ¦

¦ ¦ воротками ¦ системы ¦ ¦ ¦

¦ ¦

+-----------------------+---------+--------+------+------+------+----

-----+

¦ Испытуемая сыворотка ¦ 0,04 ¦ - ¦ 0,04 ¦ 0,04 ¦ 0,02 ¦ -

¦

¦ Физиологический раствор ¦ 0,16 ¦ 0,6 ¦ 0,36 ¦ 0,16 ¦ 0,18

¦ 0,6 ¦

¦

¦

¦ Водяная баня 63 - 64° - 30

минут ¦

¦

¦

¦ Антиген бруцеллезный ¦ 0,2 ¦ - ¦ - ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ -

¦

¦ или овисный в рабочем ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦

¦ титре ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦

¦ Комплемент в рабочем ¦ 0,2 ¦ - ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ 0,2 ¦ -

¦

¦ разведении ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦

¦

¦

¦ Холодильник плюс 2 - 6° - 16 - 18 часов и 20

минут ¦

¦ при комнатной

температуре ¦

¦

¦

¦ Гемолитическая система ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5 ¦ 0,5

¦ 0,5 ¦

¦ в рабочем титре ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦

¦

¦

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

¦ Водяная баня 37 - 38° - 20

минут ¦

L--------------------------------------------------------------------

------

Титром гемолитической системы считают наибольшее ее количество, в котором произошел

полный гемолиз в обоих рядах пробирок с негативной и испытуемой сыворотками и в безантигенном

ряду с позитивной сывороткой. Рабочий титр на один интервал ниже (например: при титре

гемолитической системы 0,6 мл рабочий титр - 0,5 мл).

Контроли реакции:

негативная и позитивная (бруцеллезная или овисная) сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10 с

антигеном и 1:5 без антигена;

гемолитическая система без сыворотки, антигена и комплемента.

4.3.6. Учет результатов РСК и РДСК.

Реакцию связывания комплемента и реакцию длительного связывания комплемента учитывают

визуально. При постановке реакций в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят

один раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани. При исследовании в трех пробирках -

через 3 - 4 часа, когда в контрольных пробах с позитивной (бруцеллезной или овисной) сывороткой

эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (в этом случае штативы с пробирками

главного опыта оставляют в холодильнике).

Результаты реакций оценивают в крестах по следующей схеме:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость

прозрачная и

бесцветная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

- (минус) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует,

жидкость

интенсивно окрашена гемоглобином.

Степень задержки гемолиза эритроцитов определяют по шкале, которую готовят перед учетом

реакции. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость из них

сливают в одну. Из этой жидкости готовят разведения с меньшим процентом гемолиза по следующей

схеме:

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

------------------------------T------T------T------T------T------

¦ Номера пробирок ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦

+-----------------------------+------+------+------+------+------+

¦ Гемолизированная жидкость ¦ 1,0 ¦ 0,75 ¦ 0,5 ¦ 0,25 ¦ - ¦

¦ Физиологический раствор ¦ - ¦ 0,25 ¦ 0,5 ¦ 0,75 ¦ 10 ¦

¦ Процент гемолиза ¦ 100 ¦ 75 ¦ 50 ¦ 25 ¦ 0 ¦

L-----------------------------+------+------+------+------+-------

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со

степенью гемолиза в пробирках шкалы и процент гемолиза выражают в крестах.

4.3.7. Диагностическая оценка РСК и РДСК.

При исследовании сывороток в одной пробирке (в разведении 1:5 с антигеном) все сыворотки,

давшие задержку гемолиза на один крест и выше, исследуют повторно в тот же или на другой день в

трех пробирках в разведениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена.

Реакцию считают: положительной - при задержке гемолиза на 2 - 4 креста в одном или в двух

разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без

антигена); сомнительной - при задержке гемолиза с оценкой в один крест. При получении

сомнительного результата сыворотки крови от животных через 15 - 30 дней исследуют повторно.

При этом животных, с сывороткой крови которых получена дважды сомнительная РСК (РДСК),

считают реагирующими положительно.

Суммарные результаты исследования испытуемых сывороток по каждой экспертизе, номера

серий, сроки годности антигена, комплемента, гемолизина и их рабочие титры записывают в журнал

серологических исследований.

В заключении лаборатории о результатах исследования сывороток крови животных указывают

диагностическую оценку каждой пробы (положительная, сомнительная, отрицательная) и показания

реакции в крестах.

4.4. Постановка и учет результатов пластинчатой реакции агглютинации с роз бенгал антигеном

(роз бенгал проба или РБП).

4.4.1. Пластинчатую реакцию агглютинации с бруцеллезным роз бенгал антигеном (РБП)

применяют для исследования сывороток крови при диагностике бруцеллеза у крупного рогатого

скота, овец, коз, лошадей, свиней, буйволов, верблюдов и северных оленей.

4.4.2. Компоненты РБП:

испытуемые сыворотки крови (см. подпункт 2.3.1);

бруцеллезный антиген, окрашенный бенгальским розовым (роз бенгал антиген) (см.

Приложение N 2, п. 6);

позитивная бруцеллезная и негативная сыворотки;

0,5-процентный фенолизированный физиологический раствор (см. Приложение N 2, п. 1).

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

4.4.3. Постановка РБП. Реакцию проводят на чистых сухих эмалированных пластинках с

лунками при температуре 18 - 30 °С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер

исследуемой сыворотки.

Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 мл вносят на дно лунки при помощи шприца-

полуавтомата (ШПРБ-1) или микропипетки. После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат

(микропипетку) трижды промывают фенолизированным физиологическим раствором и кончик

подсушивают фильтровальной бумагой.

При исследовании сывороток крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и свиней в

каждую лунку рядом с сывороткой при помощи пипетки-капельницы вносят 0,03 мл антигена, а при

исследовании сывороток крови овец, коз, буйволов и северных оленей - 0,015 мл антигена. Затем

антиген тщательно в каждой лунке смешивают с сывороткой активными движениями ручного

полисмесителя до получения однородной смеси, распределяя ее при этом по всей поверхности

лунки. После смешивания сывороток каждого ряда лунок (смесителем на 5 проб) или во всех лунках

пластинки (смесителем на 25 проб) смеситель ополаскивают фенолизированным физиологическим

раствором и просушивают марлевой салфеткой или фильтровальной бумагой.

Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 минут осторожными

вращательными движениями вручную или при помощи автоматического прибора, предназначенного

для этой цели. При положительной реакции в течение 4 минут появляются мелкие или крупные

хлопья агглютината розового цвета.

В начале работы ставят контроль антигена с негативной и позитивной бруцеллезной (с

активностью 100 - 200 МЕ) сыворотками в тех же дозах, а также контроль антигена на спонтанную

агглютинацию (к 0,03 мл антигена добавляют 0,03 мл физиологического раствора).

4.4.4. Учет результатов реакции проводят невооруженным глазом в течение 4 минут после

смешивания сывороток с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.

Реакцию считают положительной при наличии выраженной агглютинации окрашенных

бруцелл антигена в виде мелких или крупных хлопьев розового цвета, выделяющихся на белом фоне

лунки.

Реакцию считают отрицательной при отсутствии агглютинации (смесь гомогенна, равномерно

окрашена).

После учета реакции пластинки дезинфицируют погружением их на 5 минут в 3-процентный

раствор фенола, затем тщательно моют водопроводной водой, высушивают на воздухе и используют

повторно. Для проведения дезинфекции и сушки пластинок используют кассеты и штативы-сушилки.

При нечетко выраженной агглютинации проводят повторное исследование данной сыворотки

и по результатам его дают окончательную оценку реакции (положительная или отрицательная).

4.4.5. Диагностическая оценка РБП. При получении положительного результата РБП при

исследовании сывороток крови животных в благополучных по бруцеллезу хозяйствах все сыворотки,

с которыми получена положительная РБП, в тот же или на другой день исследуют в РА и РСК (см.

подпункты 4.2 и 4.3) для установления титра агглютининов и наличия комплементсвязывающих

антител. Сыворотки, с которыми получена отрицательная РБП, дополнительно в РА и РСК не

исследуют.

Диагностическую оценку результатов исследования сывороток крови и РБП проводят по

следующей схеме:

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

-------------------------------------------------T---------------

¦ Результаты реакций ¦ Диагностическая ¦

+---------------T---------------T----------------+ оценка ¦

¦ РПБ ¦ РА ¦ РСК (РДСК) ¦ ¦

+---------------+---------------+----------------+---------------+

¦ положительная ¦ положительная ¦ положительная ¦ положительная ¦

¦ положительная ¦ положительная ¦ сомнительная ¦ положительная ¦

¦ положительная ¦ положительная ¦ отрицательная ¦ положительная ¦

¦ положительная ¦ сомнительная ¦ положительная ¦ положительная ¦

¦ положительная ¦ сомнительная ¦ сомнительная ¦ положительная ¦

¦ положительная ¦ сомнительная ¦ отрицательная ¦ положительная ¦

¦ положительная ¦ отрицательная ¦ положительная ¦ положительная ¦

¦ положительная ¦ отрицательная ¦ сомнительная ¦ положительная ¦

¦ положительная ¦ отрицательная ¦ отрицательная ¦ сомнительная ¦

¦ отрицательная ¦ не исследуется ¦ не исследуется ¦ отрицательная ¦

L---------------+---------------+----------------+----------------

При получении положительного результата РБП при исследовании сывороток крови животных

в неблагополучных по бруцеллезу стадах (на фермах, в хозяйствах, населенных пунктах) овец, коз,

свиней и северных оленей, с сыворотками крови которых получена положительная РБП, признают

больными бруцеллезом, а сыворотки крови крупного рогатого скота, буйволов, лошадей и верблюдов

дополнительно исследуют РА и РСК. Диагностическую оценку результатов исследования сывороток

в РБП в этом случае проводят по схеме, приведенной выше.

В заключении лаборатории о результатах исследований сообщают диагностическую оценку

(положительная, сомнительная, отрицательная) и указывают показания всех реакций. Например,

"положительная (РБП положительная, РА 200 МЕ, РСК ++)", "сомнительная (РБП положительная, РА

-, РСК -)".

При диагностической оценке "сомнительная" сыворотку крови данного животного повторно

исследуют через 15 - 30 дней в РБП, РА и РСК (РДСК). При получении положительных или вновь

сомнительных показаний реакций результат исследования оценивают положительно.

4.5. Кольцевая реакция с молоком (КР).

4.5.1. Кольцевую реакцию применяют с целью проверки благополучия стад (ферм) по

бруцеллезу крупного рогатого скота и для проверки молока при продаже его на рынках.

Исследование молока в КР разрешается проводить только непосредственно в хозяйствах, в

ветеринарных лабораториях, на мясо-молочных и пищевых контрольных станциях.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Исследование молока в КР разрешается проводить только ветеринарным врачам лабораторий,

мясо-молочных и пищевых контрольных станций и ветеринарным врачам хозяйств, прошедшим при

лабораториях специальную подготовку по постановке и учету реакции.

4.5.2. Компоненты реакции:

исследуемое молоко (см. подпункт 2.2);

антиген цветной бруцеллезный для кольцевой реакции с молоком (см. Приложение N 2, п. 6);

сыворотка позитивная бруцеллезная.

4.5.3. Постановка кольцевой реакции.

Уленгутовские пробирки устанавливают в резиновые штативы и нумеруют в соответствии с

описью проб молока. В пробирки разливают по 0,05 мл антигена, затем шприцем с иглой длиной 50 -

60 мм, нажимая на поршень слабыми толчками, вливают в них по 1 мл молока и тщательно

смешивают его с антигеном. После каждой пробы молока шприц двукратно промывают теплой

водой.

При постановке КР в пробирках Флоринского или серологических берут по 2 мл молока и

добавляют по 0,1 мл антигена, затем пробирки тщательно встряхивают для перемешивания молока с

антигеном.

При каждой постановке реакции одновременно с испытуемыми пробами молока ставят

контроли:

с молоком от заведомо здоровой коровы (буйволицы);

со смесью молока здоровой коровы и позитивной бруцеллезной сыворотки (0,05 мл сыворотки

на 1 мл молока).

Штативы с испытуемыми и контрольными пробами молока помещают в водяную баню или

термостат при 37 - 38° на 1 час.

4.5.4. Учет и оценка результатов кольцевой реакции.

Результаты реакции учитывают визуально сразу после извлечения штативов из водяной бани

(термостата) по следующей схеме (в крестах):

+++ (3 креста) - четко выраженное синее кольцо в верхней части

столбика

молока в слое сливок (остальная часть молока

остается

белой);

++ (2 креста) - достаточно выраженное синее кольцо в слое сливок

(остальная часть молока имеет синеватый цвет);

+ (1 крест) - синее кольцо в слое сливок выражено слабо и весь

столбик

молока имеет синий цвет;

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

- (знак минус) - столбик молока остается равномерно окрашенным в

первоначальный синий цвет, который был получен сразу

после

добавления к нему антигена, а слой сливок - белого

или

слегка желтоватого цвета.

Все пробы молока, давшие кольцевую реакцию с оценкой 3 и 2 креста, считают

положительными, а с оценкой 1 крест - сомнительными.

При получении положительного или сомнительного результата КР от всех животных берут

кровь для исследования на бруцеллез в РБП или РА и РСК (РДСК), проводят эпизоотологическое

обследование хозяйства, клинический осмотр и исследование животных на заболевание маститами.

При получении отрицательных результатов исследования сывороток крови в РБП или в РА и

РСК (РДСК) у всех животных данное стадо считают благополучным по бруцеллезу, а животных, с

молоком которых получена положительная КР, оставляют в стаде.

В случае получения положительных результатов исследования на бруцеллез крови с животными

стада поступают в соответствии с инструкцией о мероприятиях по профилактике и ликвидации

бруцеллеза животных. При этом изолируют также и животных, выделенных при исследовании

молока в КР, если эта реакция не была связана с другим заболеванием животных.