Нормальными мышами

Общие положения

Представления об эндокринной функции жировой ткани впервые были сформулированы в 1953 г. Кеннеди (цитируется по Акмаеву И.Г., Сергееву В.Г., 2002), который обобщил их в виде липостатической теории. В соответствие с ней постулировалось существование некого насыщающего фактора, секретируемого в циркуляцию жировой тканью, который, воздействуя на определенные участки ЦНС, снижает аппетит и потребление пищи. Экспериментальное обоснование этой теории стало возможным после получения линий мышей с рециссивными мутациями гена ожирения (ob) и гена, ответственного за манифестацию диабета (db). Гомозиготные особи таких животных (ob/ob и db/db) характеризуются одинаковым фенотипом в виде увеличения массы тела (на 300%) по сравнению с таковой у нормальных мышей. Исходя из липостатической теории представлялось очевидным, что безудержное потребление пищи и, как следствие этого – развитие ожирения у этих мышей принципиально могло быть обусловлено двумя механизмами: отсутствием секреции насыщающего фактора и (или) утратой к нему чувствительности, например, в связи с генетической дефектностью рецепторов к этому фактору. Выяснение конкретного характера «полома» осуществлено с помощью парабиоза мышей – гомозигот ob/ob и db/db между собой, а также с нормальными мышами. Во всех случаях между двумя партнерами устанавливалось общее кровообращение за счет сшивания мышц и брюшины. Это обусловливало возможность влияния молекул, продуцируемых одним животным, на клетки-мишени не только в организме продуцента данных молекул, но и в организме второго парабионта при наличии у последнего чувствительных к этим молекулам рецепторов. Существенным условием для реализации перекрестного действия подобных молекул являлось их длительное присутствие в циркуляции, поскольку интенсивность кровотока между животными при данной экспериментальной модели была невысока (рис.1).

А В С

Рис. 1. Последствия парабиоза мышей-гомозигот db/db и ob/ob между собой и с

нормальными мышами

Было установлено, что при парабиозе db/db с нормальными мышами фенотип db/db-особи не менялся, однако наблюдалась потеря веса и смерть от истощения нормальных мышей (А). При парабиозе ob/ob с нормальными мышами изменения в фенотипе обоих парабионтов не наблюдалось (В). Наконец, при парабиозе db/db и ob/ob, последние начинали отказываться от пищи и погибали от истощения (С), тогда как db/db-мыши сохраняли свой фенотип.

Результаты этих экспериментов позволили придти к заключению, что генетический дефект мышей db/db фенотипически проявляется несостоятельностью рецепторов к насыщающему фактору при сохранении способности к продукции (и даже увеличению продукции) самого фактора. Именно при этом условии оказывается возможным вариант «А», когда секретируемый мышами db/db фактор насыщения угнетает пищевую активность у нормальных мышей, у которых имеется к нему чувствительный рецепторный аппарат. В противоположность этому генетический дефект у мышей ob/ob фенотипически проявляется неспособностью этих животных к продукции фактора насыщения при сохранном к нему рецепторном аппарате. Именно при этом условии был возможен вариант «В», когда отсутствие данного фактора стимулировало пищевую активность у животных ob/ob, но никак не могло повлиять на пищевое поведение нормальных мышей, находящихся под регуляторным воздействием собственного фактора насыщения. Такое сочетание: дефектность рецепторов к насыщающему фактору у db/db и отсутствие самого фактора у ob/ob определяло и вариант «С». В этом случае, продуцируемый фактор насыщения мышами-парабионтами db/db угнетал пищевую активность ob/ob, имеющих к нему нормальные рецепторы, но не действовал на самих db/db, у которых рецепторы утратили способность к взаимодействию с данным лигандом.

Последующие исследования гена ожирения (ob) позволили охарактеризовать и контролируемый им продукт пептидной природы, получивший название лептин (от греческого leptos – тонкий), или белка ob. Лептин представляет собой линейный пептид из 167 аминокислот, для которого характерна высокая эволюционная консервативность структуры. Его аминокислотная последовательность у человека на 84% идентична таковой в молекуле лептина мыши. По механизму биологического действия лептин является гормоном, родственным a и g - интерферонам, гормону роста и пролактину. Все эти гормоны являются a-спиральными белками и связываются с рецепторами, имеющими сходную химическую структуру (Панков Ю.А., 1999; 2003).

Изучены структура кодирующей лептин ДНК. Показано, что у мышей ген ob локализован в проксимальной части хромосомы 6 и экспрессируется, в основном, в адипоцитах белой жировой ткани, которые секретируют синтезируемый ими гормон в кровь. У человека имеется только один ген лептина (ген ob) протяженностью 20 тыс. пар оснований и локализован он на хромосоме 7q 31.3 (Панков Ю.А., 2003). Содержит 3 экзона и 2 интрона. 5¢ - фланкирующая энхансерная область гена состоит из 172 пар оснований и содержит последовательность, подобную ТАТА боксу (ТАТАGА), несколько cis – регуляторных элементов, включающих в себя три последовательности GC – типа (GGGCGG), место связывания транскрипционного фактора АР-2 и ССААТ – последовательность – место связывания белка – энхансера (Панков Ю.А., 1998; 2003). Ген лептина имеет области, способные связываться с факторами, регулирующими процесс конститутивной секреции и транскрипции, например, с глюкокортикоидами и цАМФ-реактивными элементами (Акмаев И.Г, Сергеев В.Г., 2002).

Помимо экспрессии в белой жировой ткани, ген ожирения (ob) экспрессируется также в желудке, плаценте и, возможно, в молочной железе (Мantzoros Ch.S., 1999). Сегодня на основе рекомбинантных ДНК созданы биотехнологические системы для синтеза активного белка ob в дрожжах и E. coli, что позволяет нарабатывать синтезируемый в кровь белок в количестве достаточном для изучения его биологических свойств, получения к нему антисывороток и разработки методов его количественного определения в плазме (Панков Ю.А., 2003).

Ген рецептора лептина у человека локализован на хромосоме 1 и включает в себя 20 экзонов. Рецептор к лептину обнаруживает гомологию с семейством гематопоэтических рецепторов, включающим рецепторы к гормону роста, пролактину, цитокинам, некоторым ростовым факторам: гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (Г-КСФ), гранулоцитарно-макрофагальному колониестимулирующему фактору (ГМ-КСФ), эритропоэтину. Рецепторы этого семейства связывают белки-лиганды, обогащенные a-спиральными структурами (helix bundle peptide – HBP). Общей характеристикой таких рецепторов является наличие 4 пар остатков цистеина и последовательности: Тrp-Ser - x - Тrp-Ser, которые необходимы для формирования кармана, связывающего лиганд. Вблизи трансмембранного домена рецептора располагается богатый пролинами участок, который необходим для проведения сигналов всех исследованных лигандов (Панков Ю.А., 2000).

Идентифицированы 3 различных варианта сплайсинга про-мРНК рецептора лептина мыши, в результате которого синтезируются 3 типа рецептора (Панков Ю.А., 1998): 1) растворимый рецептор лептина; 2) связанный с мембраной рецептор лептина, который имеет короткий внутриклеточный домен и не способен осуществлять трансдукцию гормонального сигнала; 3) связанный с мембраной рецептор, имеющий длинный внутриклеточный домен и способный трансдуцировать гормональный сигнал.

Рецептор лептина с длинным цитоплазматическим доменом (Ob-Rb) содержит последовательности, которые определяют взаимодействие цитоплазматического домена с киназой Януса (Janus kinase – Jak), являющейся цитоплазматической тирозинкиназой. Фосфорилирование Jak вызывает ее активацию и, в свою очередь, индуцирует фосфорилирование других белков, в частности, белков – трансдукторов сигнала и активаторов транскрипции – STAT (signal transducers and activators of transcription): STAT-1; STAT-2; STAT-3.После фосфорилирования белки STAT димеризуются и переносятся в ядро, где связываются со специфическими сайтами ДНК и активируют транскрипцию генов. Рецептор лептина в опытах in vitro стимулирует фосфорилирование STAT-1, 2 и 3, а in vivo (после связывания с гормоном в гипоталамусе) активирует фосфорилирование только белка STAT-3. Такой механизм с участием Jak впервые был описан для рецепторов a и g-интерферонов. В проведении сигналов «спиральных» гормонов через рецепторы наряду с белками STAT принимают участие также каскад МАР-киназ, PRAR, рецепторы глюкокортикоидов и другие белки цитоплазмы (Панков Ю.А., 2003).

Специфические лептиновые рецепторы располагаются в различных областях мозга, включая гипоталамус, мозжечок, кору, гиппокамп, таламус, сосудистые сплетения и эндотелий мозговых капилляров. Экспрессия лептиновых рецепторов выявляется также в периферических тканях, включая легкие, почки, печень, поджелудочную железу, надпочечники, яичники, стволовые клетки гемопоэза и скелетные мышцы. Столь широкая распространенность этих рецепторов в организме может свидетельствовать о широком диапазоне влияний лептина, который пока еще изучен недостаточно. Предполагается, (Мantzoros Ch.S., 1999) что короткая изоформа лептинового рецептора, присутствующая в почках, регулирует клиренс лептина, а изоформы рецептора лептина, находящиеся в эндотелии капилляров и в сосудистых сплетениях головного мозга, обеспечивают транспорт лептина из крови в интерстициальную ткань головного мозга и в спинномозговую жидкость через гематоэнцефалический барьер – ГЭБ (насыщаемую систему с ограниченной пропускной способностью).

Одиночная мутация в гене рецептора приводит к ненормальному сплайсингу и блокирует экспрессию длинной формы рецептора лептина (у мышей db/db), что вызывает нарушение проведения гормонального сигнала и избыточное накопление лептина в крови (Панков Ю.А., 1999).