Морфологические особенности эритроцитов и их предшественников. Строение и функции гемоглобина, виды гемоглобинов.

Гемоглобин является дыхательным пигментом, относящимся к группе хромопротеидов. Он составляет около 95 % всей твердой части эритроцита. Гемоглобин это сложный белок, состоящий из белковой части - глобина и простетической части - гема. Молекула гемоглобина содержит 1 глобин и 4 гема. В каждом эритроците содержится около 289 млн. молекул гемоглобина. Гем представлен комплексом протопорфирина IX с железом. Одним из этапов синтеза гема является образование протопорфирина. Порфирины синтезируются во всех клетках организма, но основная масса в ядерных клетках эритроидного ростка КМ. Для синтеза одной молекулы гема необходимо 8 молекул аминокислоты глицина. В соединение с ним вступает янтарная кислота. Для осуществления этой связи в качестве кофермента необходим пиродоксаль-фосфат - производное витамина В₆. В результате реакции образуется α-амино-β-кетоадипиновая кислота, которая очень нестойкая и при отщеплении от нее группы СО₂ образуется δ-аминолевулиновая кислота (АЛК), из 2-х молекул которой образуется порфибилиноген (ПБГ). ПБГ под действием ферментов превращается в протопорфириногн III, а затем в протопорфириноген IX и протопорфирин IX. Протопорфирин IX при участии гемсинтетазы соединяется с Fe²⁺ и образуется гем. Протопорфирин состоит из 4-х пирроловых колец, в центре которых находится железо, соединенное с 4-мя атомами азота пирроловых колец двумя главными и двумя дополнительными связями. Так как координационное число железа равно 6, то остаются 2 неиспользованные координационные связи: с одной из них связывается глобин, а к другой присоединяется кислород или другие лиганды. Гем также синтезируется в мышцах для образования миоглобина, в клетках печени, для образования пероксидазы, цитохромов, каталазы.

Гем одинаков для всех видов гемоглобина, и различия в свойствах гемоглобина связаны с различием глобина.

Молекула гемоглобина представляет собой тетрамер, состоящий из 4-х полипептидных цепей. У человека продуцируются несколько типов цепей гемоглобина, которые при различных сочетаниях между собой определяют тип гемоглобина. У лиц с нормальным геномом встречается 4 типа полипептидных цепей глобина: α, β, γ и δ, отличающихся по составу и количеству аминокислот. В различные периоды развития человека отмечаются различные виды гемоглобина. В период онтогенеза выявляется гемоглобин Р (примитивный), к 8-ой неделе гестации 90 % составляет HbF. Он остается доминирующим весь период внутриутробного развития. Синтез HbA начинается с 9-ой недели гестации. К моменту рождения его содержание колеблется от 5 до 45 %.Затем его синтез резко увеличивается, а синтез HbF падает и к 6-ти месяцам его доля составляет менее 3 %, а HbA - 95-98 %. У взрослого к нормальным типам гемоглобина относятся HbA (α₂ β₂ - основной гемоглобин взрослого, 95-98 %), HbF (α₂γ₂ - фетальный гемоглобин, 0,5-1 %), HbA₂ (α₂δ₂ - минорный гемоглобин взрослого, 1,5-3,5 %).

Эритроцит является высокоспециализированной клеткой, основная задача которой состоит в транспорте кислорода из легких в ткани и двуокиси углерода обратно в легкие. Эта функция осуществляется гемоглобином эритроцитов. Каждая молекула гемоглобина может обратимо связывать и транспортировать не более 4-х молекул кислорода.

Виды гемоглобина

В период внутриутробного развития зародыша (7-12 недель) эритроциты содержатпримитивный гемоглобин (HbP), на 9-й неделе появляется гемоглобин фетальный HbF, а перед рождением – гемоглобин взрослых (HbА). Фетальный гемоглобин в течение первого года жизни ребенка полностью заменяется на HbА. Примитивный и фетальный гемоглобины обладают более высоким сродством к кислороду, что обеспечивает его насыщение кислородом при более низком парциальном давлении.

Соединения гемоглобина

В норме гемоглобин содержится в виде нескольких соединений:

1) Восстановленный, или дезоксигемоглобин (Hb). Имеет 4 свободных связи, к которым могут присоединяться лиганды – кислород, угарный газ.

2) Оксигемоглобин (HbО₂). Образуется из восстановленного гемоглобина присоединением кислорода.

3) Карбгемоглобин (HbСО₂). Образуется в тканях после присоединения к гемоглобину углекислого газа.

Примерно 8-9% гемоглобина в крови находится в виде соединенияметгемоглобин (MetHb). Метгемоглобин образуется в результате взаимодействия со свободными радикалами. Железо в метгемоглобине находится в трехвалентной форме, поэтому метгемоглобин не способен взаимодействовать с кислородом.

При отравлениях угарным газом образуется карбоксигемоглобин (HbСО). Обладает высоким сродством к кислороду, поэтому при небольших концентрациях угарного газа в крови гемоглобин блокируется и теряет способность транспортировать кислород.

27. Методы определения и выявления нормальных и патологических видов гемоглобина.

МЕТОДЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ВИДОВ ГЕМОГЛОБИНА

1. Для разграничения отдельных типов человеческого гемоглобина пользуются электрофорезом на блоке крахмала, на крахмальном геле, на геле агара, на целлюлозно-ацетатных листах, на акриламидном геле, на карбоксиметилцеллюлозном геле, электрофорезом при высоком напряжении тока.

2. Вторым по значению методом, которым пользуются в настоящее время для дифференциации отдельных видов гемоглобина, является хроматография0.

Особенно хорошие результаты получается при употреблении в мкачестве адсорбирующего вещества ионообменной смолы амберлита и ионообменный декстрановый гель. На рис. 17 даныхарактеристики различных типов гемоглобина, полученных при

применении амберлита при рН=6,0.

3. Для разграничения некоторых видов гемоглобина

пользуются также их растворимостью в некоторых растворителях0.

Наиболее известным тестом этой группы является проба Итано для доказательства наличия HbS. При этой пробе нам служит то обстоятельство, что редуцированный HbS осаждается в 2,24 m буфере, в противоположность другим типам гемоглобина

(рис. 18). Проба эта имеет значение в особенности для дифференцирования HbS и HbD, потому что, как видно из рис. 18, HbS и HbD обладают одинаковой электрофоретической и

хроматографической подвижностью.

4. Для отличия HbA от HbF пользуются, как было подчеркнуто выше, устойчивостью при денатурации растворами натриевой щелочи. Это известный в истории метод, которым

Кербер в 1886 году дифференцировал HbA и HbF.

5. Гемоглобины группы F (HbF, Hb Феллас, Hb Александра и Hb Бартс) отличается от других гемоглобиновых типов и по своей

характерной триптофановой полосе при 289,8 нм ультрафиолетового спектра. Гемоглобины, обладающие группой М,

не имеют абсорбционной полосы при длине волны 630 нм, но зато

показывают увеличенную абсорбцию при 600 нм.

6. "Отпечатковый метод0". Дело касается важнейшего метода установления "первичной структуры" гемоглобина при различных

гемоглобиновых типах. Исследуемый гемоглобин гидролизуют

трипсином, при чем полипептидные цепи глобиновой молекулы распадаются на большое число пептидов. Пептидную смесь подвергают электрохроматографии на бумаге, т.е. в одном

направлении проводится электрофоретическое, в другом хроматографическое разделение. Получаются характерные для отдельных типов гемоглобинов электрохроматограммы, по которым их можно точно различить. Определение аминокислотного состава отдельных пептидов дает возможность первичную структуру глобина соответствующего гемоглобинового типа. Делая аналогию с соответствующей по сложности и точности криминалистической техникой для изучения отпечатков пальцев рук, он был назван "пальцеотпечатковым" ("fingerprint")

методом.

7. Для определения состава полипептидных цепей в каком-нибудь гемоглобиновом типе можно воспользоваться и так называемым "2рекомбинационным0" или "2гибридизационным0" методом.

Если смешать известный и неизвестный гемоглобин при рН 4,3, они диссоциируют полумолекулами, состоящими из соответствующих пар полипептидных цепей. После нейтрализации раствора полипептидные пары снова комбинируются в целые гемоглобиновые

молекулы, при чем могут получится и новые "гибридные" гемоглобиновые молекулы. Их идентифицирование электрофоретическим способом или хроматографией позволит

сделать заключение о полипептидной структуре неизвестного гемоглобинового типа. Этот метод предназначен также преимущественно для научных исследовательских целей.

8.2 Иммунологические методы.

9. Кроме вышеуказанных методов при дифференциации отдельных типов гемоглобина пользуются также 2различиями в 2кристаллическом строении, изоэлектрической точке и т.д.

10. Разработаны также методы 2цитологического определения

типа гемоглобина в эритроцитах на мазке крови. Так наличие HbF в эритроцитах можно доказать путем обработки кровяного мазка лимоннокислой буферной смесью с рН 3,2-3,6. При этих условиях HbA извлекается и эритроциты, в которых он преобладал, остаются только в виде эритроцитных теней, тогда как HbF сохраняется и эритроциты, содержащие преимущественно этот тип

гемоглобина, сохраняют свое содержание.

28. Концентрация гемоглобина и содержание эритроцитов: методы определения, диагностическое значение.

1. Количество эритроцитов.

Универсальные методы подсчета (камера Горяева, автоматический счетчик). Исследуется капиллярная кровь.

Нормальные величины: м. 4-5 х 10¹²/л

ж. 3,7-4,7 х 10¹²/л

При использовании для подсчета электронных счетчиков исследуется цельная кровь (ЭДТА). Проба стабильна 24 часа при 23^оС, 48 часов при 4^оС.

Нормальные величины: х 10¹²/л

Кровь из пуповины 3,9-5,5

1-3 дня (капил.) 4,0-6,6

1 неделя 3,9-6,3

2 недели 3,9-5,9

1 месяц 3,3-5,3

2 месяца 2,7-4,9

3-6 месяцев 3,5-5,5

6 мес.-2 года 3,7-5,3

2-6 лет 3,9-5,3

6-12 лет 4,0-5,2

12-18 лет, м. 4,5-5,3

ж. 4,1-5,1

18-49 лет, м. 4,5-5,9

ж. 4,0-5,2

Увеличение количества эритроцитов наблюдается при:

- эритремии (абсолютный первичный эритроцитоз),

- реактивных эритроцитозах, вызванных гипоксией (вентиляционная недостаточность при бронхо-легочной патологии, врожденные и приобретенные пороки сердца, пребывание на значительных высотах),

- вторичные эритроцитозы, вызванные повышенной продукцией эритропоэтинов (гидронефроз и поликистоз почек, новообразования почек и печени, семейный доброкачественный эритроцитоз),

- эритроцитозы, связанные с избытком стероидов в организме (болезнь и синдром Кушинга, феохромоцитома, гиперальдостеронизм, лечение стероидами),

- относительные эритроцитозы при дегидратации.

Уменьшение количества эритроцитов наблюдается при:

- анемии (железодефицитная, гемолитическая, гипопластическая, В₁₂-дефицитная),

- острая кровопотеря,

- поздние сроки беременности,

- хронический воспалительный процесс,

- гипергидратация.

2. Гемоглобин.

Унифицированный гемоглобинцианидный метод, колориметрия, гематологический счетчик.

Исследуется цельная кровь. Проба стабильна 48 часов при 4^оС, 24 часа при 23^оС.

Нормальные величины: г/л

Кровь из пуповины 135-205

1-3 дня (капил.) 145-225

1 неделя 135-215

2 недели 134-198

1 месяц 107-171

2 месяца 94-130

3-6 месяцев 103-141

6 мес.-2 года 110-140

2-5 лет 110-140

5-9 лет 115-145

9-12 лет, 120-150

12-14 лет, м. 120-160

ж. 115-120

15-17 лет, м. 117-166

ж. 117-153

18-44 года, м. 132-173

ж. 117-155

45-64 года, м. 131-172

ж. 117-160

65-74 года, м. 126-174

ж. 117-161

Увеличение количества гемоглобина наблюдается при:

- первичных и вторичных эритроцитозах,

- относительном эритроцитозе при дегидратации,

- чрезмерной физической нагрузке, возбуждении, на больших высотах, у заядлых курильщиков.

Уменьшение количества гемоглобина наблюдается при:

- анемии (железодефицитная, гемолитическая, гипопластическая, В₁₂-дефицитная),

- острая кровопотеря (в первые сутки кровопотери из-за сгущения крови, обусловленной большой потерей жидкости, концентрация гемоглобина не соответствует картине истинной анемии),

- скрытые кровотечения,

- заболевания, сопровождающиеся выраженной эндогенной интоксикации (злокачественные опухоли и их метастазы),

- поражения костного мозга, почек и некоторых других органов,

- гемодилюция (ложная анемия).

Примечание: концентрация гемоглобина ниже между 17 и 7 часами утра и после приема пищи (х на 10 %), при взятии крови в положении лежа. Ниже у недоношенных, чем у доношенных детей.