Структуры ДНК высших порядков организации

В предыдущих разделах кратко описана структура собственно молекулы ДНК вне ее связи с другими компонентами хроматина. Все последующие уровни организации этого биополимера охватывают структу­ру супрамолекулярного комплекса ДНК.

В составе хроматина молекула ДНК находится во взаимодействии с большим количеством белков (мас­совое соотношение ДНК:белок в ядрах разных клеток различается, но в среднем близок к соотношению 1:1 — 1:2), которые делят на 2 неодинаковые группы гистоны и негистоновые белки хроматина. Гистоны (белки основного характера, растворимые в кислотах) составляют большую часть (до 80 %) суммарных ядер­ных белков, негистоновые белки (кислые, нейтраль­ные и некоторые слабо основные) составляют количе­ственно меньшую часть ядерных белков, но объединя­ют в своей группе значительно большее разнообразие структурных, ферментативных и регуляторных белко­вых компонентов хроматина.

Структура нуклеогистонового комплекса хорошо изучена и определяется 2 уровнями его организации: нуклеосомным и нуклеомерным. Нуклеосомы представляют собой нуклеопротеидные частицы диа­метром 10 нм, состоящие из центральной (коровой) белковой частицы с соленоидоподобной укладкой дву-нитевой молекулы ДНК на ее поверхности. Коровая частица является октамером 4 гистонов (у человека — гистоны Н2а, Н2Ь, НЗ и Н4), по 2 молекулы каждого на 1 частицу. Длина участка ДНК, непосредственно кон­тактирующая с коровой частицей, составляет 140 пар нуклеотидов (п.н.), что соответствует молекулярной массе (ММ) ок. 100 кДа. ДНК, контактирующая с ко-ровыми частицами, стерически защищена от действия эндонуклеаз. Молекула ДНК образует на поверхности коровой частицы 2 витка, после чего, не обрываясь, переходит на следующую коровую частицу. Длина свободного участка ДНК между соседними коровыми частицами (линкер) оценивается в 30-60 п.н. (10-20 нм). Морфологически нуклеосомный уровень орга­низации хроматина выглядит, как «бусинки на нитке».

Схема организации хроматина и N-i гистона НЗ человека (а), возможные сайты посттрансляционных модификаций гистонов НЗ и Н4 (б).

На поверхности нуклеосомы N-конец гистона Н и концы других гистонов, представлены в виде коне тивного домена; на схеме гистона НЗ отмечены мес: иболее распространенных посттрансляционных мо; каций: ацетилирование (флажок), фосфорилирован (кружок) и метилирование (шестиугольник), вполне можны и некоторые модификации в глобулярном до: Обращает на себя внимание пространственная per ность мест модификаций, звездочка указывает на тс Lys-9 может быть как ацетилирован, так и метилирован.

С линкером ассоциирован гистон HI, защающий свободный вненуклеосомный участок ДН действия эндонуклеаз и имеющий значение для фо рования следующего уровня организации хромати нуклеомеров, которые являются олигоме нуклеосом, образующими супербидную (от англ. i beads — большие шары) спираль. Нуклеомерная организация свойственна транскрипционно неактивному хроматину и обеспечивает его высокий уровень пактизации и защиты от нуклеазного расщепления.

Присутствие нуклеосом в промоторных участках генов препятствует образованию инициаторного ком­плекса транскрипции, в состав которого входят РНК-полимераза и факторы транскрипции, и для инициа­ции транскрипции необходимо локальное разрушение нуклеосомной структуры хроматина в окрестностях промотора и регуляторных элементов. При этом кон­ститутивно транскрибируемые гены вовсе не имеют нуклеосомной структуры в промоторной области.

Не вполне ясен механизм, посредством которого поддерживается непрерывное существование участка в виде свободной от нуклеосом последовательности ДНК: либо факторы транскрипции успевают провза-имодействовать с промоторным участком еще до сбор­ки нуклеосом, либо эти факторы связываются с соот­ветствующими участками ДНК, содержащими нуклео­сомы, и дестабилизируют последние. В пользу такого предположения свидетельствует способность коровых гистонов к многочисленным обратимым модификаци­ям: фосфорилированию, ацетилированию, метилиро­ванию — которые вызывают конформационные изме­нения молекул и соответственно изменение белок-бел­ковых взаимодействий. В частности, химическая модификация консервативных доменов гистонов НЗ и Н4 вызывает дестабилизацию корового октамера, ко­торый диссоциирует с освобождением 2 димеров Н2а/Н2Ь; димеры же НЗ/Н4 сохраняют связь с ДНК, но структурно не препятствуют прохождению репли-кативного или транскрипционного комплексов.

Таким образом, обратимая сборка-разборка нук­леосом является регуляторным элементом функцио­нальной активации генов, а хранение транскрипцион-но неактивного хроматина в форме супербидной спи­рали хромомеров предотвращает риск нуклеазного переваривания генетического материала.

; Значительно менее изучены взаимоотношения ДНК с негистоновыми белками хроматина. В первую очередь, это связано с огромным количеством негисто­новых белков, часть которых обладает видовой и тка­невой специфичностью. По данным двухмерного элек­трофореза, число негистоновых белков ядра превыша­ет 450, включая модифицированные формы, однако это количество учитывает только мажорные фракции, доступные визуализации при существующих методах неспецифического окрашивания электрофореграмм. учетом минорных белковых компонентов клеточно го ядра реальное количество негистоновых белков хроматина может измеряться тысячами.

До сих пор отсутствует единая классификация не­гистоновых белков, для их классификации используют прочность их связи с хроматином (экстрагируемость), физико-химические (растворимость, изоэлектричес-кая точка, молекулярная масса, подвижность при элек­трофорезе и др.), функциональные свойства, фермен­тативную активность.

Часто негистоновые белки классифицируют на ос­новании способа их выделения из препаратов тоталь­ного хроматина в растворах различной ионной силы и с содержанием разных диссоциирующих агентов. Так, до 10 % негистоновых белков может быть извле­чено из хроматина экстракцией 0,35 М NaCl (глобули-новая фракция хроматина); до 90 % негистоновых бел­ков удаляются обработкой ядер 2,0 М NaCl с 5 М мо­чевины или 37 %-ным раствором гуанидин-хлорида. Большая часть остаточных после такой экстракции белков может быть отделена додецилсульфатом натрия (SDS), 2-меркаптоэтанолом и щелочью. Однако и пос­ле такой обработки с ДНК остается связанной неболь­шое количество белка, который не удаляется даже при депротеинизации ДНК фенолом или хлороформом. Следовательно, взаимоотношения ДНК с разны­ми негистоновыми белками неравнозначны, и гово­рить о нативной структуре супрамолекулярного ком­плекса хроматина можно только с позиции сохранения интактности тех или иных взаимодействий в конкрет­ных препаратах изолированного хроматина.

Из всего многообра­зия негистоновых белков хроматина следует выделить компоненты ядерного матрикса (скелетной фибрил­лярно-гранулярной структуры ядра) и- небольшую группу обычно сопутствующих им белков (компонен­ты подмембранного фиброзного слоя ядра — ламины, белки ядерных пор и некоторые другие). Именно эти компоненты клеточного ядра образуют простран­ственную матрицу, на которой происходит регулируе­мое функционирование молекулы ДНК.

Ген — материальный носитель наследственной информации, совокупность которых родители передают потомкам. В настоящее время, в молекулярной биологии установлено, что гены — это участки ДНК, несущие какую-либо целостную информацию — о строении одной молекулы белка или одной молекулы РНК. Эти и другие функциональные молекулы определяют рост и функционирование организма.

В то же время, каждый ген характеризуется рядом специфических регуляторных последовательностей ДНК, таких как промоторы, которые принимают непосредственное участие в регулировании проявлением гена. Регуляторные последовательности могут находиться как в непосредственной близости от открытой рамки считывания, кодирующей белок, или начала последовательности РНК, как в случае с промоторами (так называемые cis-регуляторные элементы, англ. cis-regulatory elements), так и на расстоянии многих миллионов пар оснований (нуклеотидов), как в случае с энхансерами и супрессорами (иногда классифицируемые как trans-регуляторные элементы, англ. trans-regulatory elements). Таким образом, понятие гена не ограничено только кодирующим участком ДНК, а представляет собой более широкую концепцию, включающую в себя и регуляторные последовательности.

Изначально термин ген появился как теоретическая единица передачи дискретной наследственной информации. История биологии помнит споры о том, какие молекулы могут являться носителями наследственной информации. Большинство исследователей считали, что такими носителями могут быть только белки, так как их строение (20 аминокислот) позволяет создать больше вариантов, чем строение ДНК, которое составлено всего из четырёх видов нуклеотидов. Позже было экспериментально доказано, что именно ДНК включает в себя наследственную информацию, что было выражено в виде центральной догмы молекулярной биологии.

Гены могут подвергаться мутациям - случайным или целенаправленным изменениям последовательности нуклеотидов в цепи ДНК. Мутации могут приводить к изменению последовательности, а следовательно изменению биологических характеристик белка или РНК, которые, в свою очередь, могут иметь результатом общее или локальное изменённое или анормальное функционирование организма. Такие мутации в ряде случаев являются патогенными, так как их результатом является заболевание, или летальными на эмбриональном уровне. Однако, далеко не все изменения последовательности нуклеотидов приводят к изменению последовательности белка (благодаря эффекту вырожденности генетического кода) или к существенному изменению последовательности и не являются патогенными. В частности, геном человека характеризуется однонуклеотидными полиморфизмами и вариациями числа копий (англ. copy number variations), такими как делеции и дупликации, которые составляют около 1% всей нуклеотидной последовательности человека[1]. Однонуклеотидные полиморфизмы, в частности, определяют различные аллели одного гена.

Эпигенетика — наука об эпигенетическом наследстве, наборе обратимых наследуемых изменений функций гена или другого фенотипа клетки, который происходит без изменений в последовательности ДНК генотипа. При этом работают биохимические механизмы, влияющие на активность генов, например, метилирование промоторов, что приводит к подавлению активности генов. Такие изменения могут быть вызваны спонтанно, в ответ на изменение факторов окружающей среды или в ответ на наличие определённого аллеля, даже если он отсутствует в последующих поколениях. Однако указанное наследование не является постоянным. Без внешнего воздействия, первоначально вызвавшего эти изменения, они сохраняются на протяжении одного или нескольких поколений, а затем исчезают.

Известные эпигенетические механизмы: метилирование ДНК; ремоделирование хроматина; регуляция на уровне РНК; в частности, РНК-интерференция; прионизация белков; инактивация X-хромосомы.

Центральная догма молекулярной биологии — обобщающее наблюдаeмоe в природе (эмпирическое) правило реализации генетической информации: информация передаётся от нуклеиновых кислот к белку, но не в обратном направлении. Правило было сформулировано Френсисом Криком в 1958 году и приведено в соответствие с накопившимися к тому времени данными в 1970 году. Переход генетической информации от ДНК к РНК и от РНК к белку является универсальным для всех без исключения клеточных организмов, лежит в основе биосинтеза макромолекул. Репликации генома соответствует информационный переход ДНК->ДНК. В природе встречаются также переходы РНК->РНК и РНК->ДНК (например у некоторых вирусов), а также измение конформации белков, передаваемое от молекулы к молекуле.

Транскрипция - биологический процесс, в результате которого информация, содержащаяся в участке ДНК, копируется на синтезируемую молекулу информационной РНК. Транскрипцию осуществляют факторы транскрипции и РНК-полимераза. В эукариотической клетке первичный транскрипт (пре-иРНК) часто редактируется. Этот процесс называется сплайсингом.

Зрелая иРНК считывается рибосомами в процессе трансляции. В прокариотических клетках процесс транскрипции и трансляции не разделён пространственно, и эти процессы сопряжены. В эукариотических клетках место транскрипции клеточное ядро отделено от места трансляции (цитоплазмы) ядерной мембраной, поэтому иРНК транспортируется из ядра в цитоплазму. иРНК считывается рибосомой в виде трёхнуклеотидных "слов". Комплексы факторов инициации и факторов элонгации доставляют аминоацилированные транспортные РНК к комплексу иРНК-рибосома.

Ге́нная инжене́рия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма.

Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная биология, цитология, генетика, микробиология. Самым ярким событием, привлёкшим наибольшее внимание и очень важным по своим последствиям, была серия открытий, результатом которых явилось создание методов управления наследственностью живых организмов, причём управления путём проникновения в «святая святых» живой клетки — в её генетический аппарат.

Учёные, биохимики и молекулярные биологи научились модифицировать гены или создавать совершенно новые, комбинируя гены различных организмов. Они научились также синтезировать гены, причём точно по заданным схемам. Они научились вводить такие искусственные гены в живые организмы и заставили их там работать. Это было начало генетической инженерии. Задумаемся над следующим обстоятельством.

Основа микробиологической, биосинтетической промышленности — бактериальная клетка. Необходимые для промышленного производства клетки подбираются по определённым признакам, самый главный из которых — способность производить, синтезировать, при этом в максимально возможных количествах, определённое соединение — аминокислоту или антибиотик, стероидный гормон или органическую кислоту.

Иногда надо иметь микроорганизм, способный, например, использовать в качестве «пищи» нефть или сточные воды и перерабатывать их в биомассу или даже вполне пригодный для кормовых добавок белок. Иногда нужны организмы, способные развиваться при повышенных температурах или в присутствии веществ, безусловно смертельных для других видов микроорганизмов. Задача получения таких промышленных штаммов очень важна, для их видоизменения и отбора разработаны многочисленные приёмы активного воздействия на клетку — от обработки сильно действующими ядами до радиоактивного облучения.

Цель этих приёмов одна — добиться изменения наследственного, генетического аппарата клетки. Их результат — получение многочисленных микробов-мутантов, из сотен и тысяч которых учёные потом стараются отобрать наиболее подходящие для той или иной цели. Создание приёмов химического или радиационного мутагенеза было выдающимся достижением биологии.

Но их возможности ограничиваются природой самих микроорганизмов. Они не способны синтезировать ряд ценных веществ, которые накапливаются в растениях, прежде всего в лекарственных и эфирномасличных. Не могут синтезировать вещества, очень важные для жизнедеятельности животных и человека, ряд ферментов, пептидные гормоны, иммунные белки, интерфероны да и многие более просто устроенные соединения, которые синтезируются в организмах животных и человека. Разумеется, возможности микроорганизмов далеко не исчерпаны. Из всего изобилия микроорганизмов использована наукой, и особенно промышленностью, лишь ничтожная доля.

Для целей селекции микроорганизмов большой интерес представляют, например, бактерии анаэробы, способные жить в отсутствие кислорода, фототрофы, использующие энергию света подобно растениям, хемоавтотрофы, термофильные бактерии, способные жить при температуре, как оказалось недавно, около 110°С, и др.

И всё же ограниченность «природного материала» очевидна. Обойти ограничения пытались и пытаются с помощью культур клеток и тканей растений. Это очень важный и перспективный путь. За последние несколько десятилетий учёные создали методы, благодаря которым отдельные клетки тканей растения или животного можно заставить расти и размножаться отдельно от организма, как клетки бактерий.

Это было важное достижение — полученные культуры клеток используют для экспериментов и для промышленного получения некоторых веществ, которые с помощью бактериальных культур получить невозможно. Но здесь тоже есть свои трудности, например неспособность животных клеток в культуре делиться бесконечное число раз, как это происходит с бактериями.

Кроме того, получить и выращивать культуры клеток труднее, чем бактериальные культуры. (Есть и свои преимущества, но о них пойдёт речь дальше, так как они оказались кстати уже в новых условиях, когда биотехнология сформировалась и начала своё самостоятельное развитие.) И учёные стремились научиться изменять гены, вводить нужные гены в живой организм, так сказать, «редактировать» книгу природы.

Около десяти лет назад было сделано несколько фундаментальных открытий. Был впёрвые получен изолированный, «химически чистый» ген. Затем были открыты ферменты — рестриктазы и лигазы. С помощью рестриктаз ген можно разрезать на кусочки — нуклеотиды. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать», соединять в иной комбинации, конструируя новый ген.

Почти одновременно успешно завершились многолетние попытки «прочитать» ту биологическую информацию, которая «записана» в генах. Эта работа была проделана английским учёным Ф. Сенгером и американским учёным У. Гилбертом. За неё учёные были удостоены Нобелевской премии по химии (1980). Для Сенгера эта премия была уже второй; он стал первым химиком, получившим награду дважды; первый раз он был награждён за расшифровку строения белка.

Как известно, в генах содержится информация-инструкция для синтеза в организме молекул белков-ферментов. Значит, для того чтобы заставить клетку синтезировать новые, необычные для неё вещества, надо чтобы в ней синтезировались соответствующие наборы ферментов. А для этого необходимо или целенаправленно изменить находящиеся в ней гены, или ввести в неё новые гены, чуждые ей. Изменения генов в живых клетках — это мутации. Они происходят под действием, например, мутагенов — химических ядов или излучений. Но такие изменения нельзя контроли-ровать или направлять. Поэтому учёные сосредоточили усилия на попытках разработать методы введения в клетку новых, совершенно определённых генов, нужных человеку. Для этого, во-первых, необходимо было научиться получать желаемые гены.

Первоначально такие гены пытались просто выделить из подходящих клеток, но потом оказалось, что, зная их строение, проще получать их синтетически, с помощью отработанных биохимических методик. Во-вторых, необходимо было разработать методику введения гена в клетку. Причём нужно было научиться не просто вводить ген в цитоплазму, а встраивать его в собственную молекулу ДНК клетки, так, чтобы новая информация могла быть «прочитана» биосинтетическим аппаратом клетки, вырабатывающим белки, а также воспроизводящим гены при делении клетки. Осуществление этих двух этапов — получение гена и введение его в клетку — и составляет, собственно, основу той отрасли биотехнологии, которая получила название индустрии ДНК.

Разработать методику, как первого, так и второго этапов было невероятно трудно. Однако за очень короткий срок биохимики научились синтезировать гены. Сейчас процесс синтеза генов разработан очень хорошо и даже автоматизирован. Существуют специальные аппараты, снабжённые ЭВМ, в памяти которых заложены программы синтеза различных структурных генов. За день такой аппарат синтезирует необходимые отрезки ДНК длиной в 100—120 азотистых оснований (содержащих информацию для синтеза участка полипептидной цепи белка в 30-40 аминокислотных остатков).

Основные трудности были связаны с введением готового гена в наследственный аппарат клетки. Собственно, именно из-за этих трудностей ещё 15-20 лет назад затеи с модификацией генетического аппарата считали безнадёжным и даже фантастическим делом.

Необходимо было создать общий и воспроизводимый метод включения кусочков гена в полный генетический аппарат клетки. При этом новый фрагмент гена должен был быть помещён очень точно с соблюдением ряда условий, для того чтобы клетка действительно начала синтезировать новые ферменты. Надо было также обойти сопротивляемость клетки-хозяина: как правило, все изменения генетического аппарата воспринимаются клеткой как «ошибки информации» и исправляются специальными механизмами.

Однако в природе наблюдаются случаи, когда чужеродная ДНК (вируса или бактериофага) включается в генетический аппарат клетки и с помощью её обменных механизмов начинает синтезировать «свой» белок. Учёные исследовали особенности внедрения чужеродной ДНК и использовали как принцип введения генетического материала в клетку.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время геном человека полностью расшифрован. Общее количество генов составляет 30-40тыс. Общее количество белков, закодированных в человеческой ДНК значительно больше. В настоящее время программы изучения структуры и функций ДНК человека призваны обеспечить возможность решения задач лечения сложных и наследственных заболеваний, получения лекарственных препаратов с заданными свойствами и многих других, включая ответ на главный вопрос биологической науки: «Что такое жизнь».

Литература:

1. Т.Т.Березов Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия. М.Медицина 2002 656 с.

2. Кнорре Д. Г., Мызина С. Д. Биологическая химия. – М.: Высш. шк. 1998, 479 с.;

3. Р.Марри, Д.Греннер, П.Мейес, В.Родуэлл Биохимия человека М.Мир 2000

4. Молекулярная биология. Структура и функции белков /Под ред. А. С. Спирина // М.: Высш. шк., 1996, 335 с.;

5. Филиппович Ю. Б., Егорова Т. А., Севастьянова Г. А. Практикум по общей биохимии // М.: Просвящение, 1982, 311с.;

6. Becker J., Craig E. A. Heat-shock proteins as molecular chaperones // Eur. J. Biochem., 1994, V. 219, р. 11-23.

7. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки // М.: Мир, 2005, 1656 с.;