Культивирование вирусов.

Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты. Они размножаются в живых клетках и не растут на искусственных питательных средах, поэтому методы культивирования вирусов отличаются от методов культивирования бактерий.

Методы культивирования.

1. На лабораторных животных. Заражают животных (подкожно, внутримышечно, внутрибрюшино), которые чувствительны к определенным вирусам: хорьков - вирусом гриппа, кроликов - вирусом бешенства, обезьян - вирусом полиомиелита. Индикация (обнаружение) вируса проводится по признакам заболевания. Недостаток метода - не все вирусы можно культивировать на животных, например, животные невосприимчивы к вирусам человека.

2. В куриных эмбрионах. Заражают куриный эмбрион (аллонтоисная полость, хорион-аллонтоисная оболочка, амниотическая полость, желточный мешок, сам эмбрион). Куриный эмбрион – очень удобен. Он защищен от попадания других микробов (стерильный), техника работы с ним проста, можно накопить большое количество вирусов. Индикация: а) по специфическим поражениям на хорион-аллантоисной оболочке, по гибели эмбриона, б) по реакции склеивания эритроцитов – реакции гемагглютинации (РГА). Недостатки метода: а)не все вирусы (вирус полиомиелита, вирус ящура) можно вырастить в куриных эмбрионах; б) невозможно обнаружить микроб без вскрытия эмбриона; в) в нем много загрязняющих белков и других соединений.

3. В тканевых культурах. Тканевые культуры или клеточные культуры – клетки, выращенные вне организма на искусственных питательных средах. Для их приготовления используют чаще всего эмбриональные и опухолевые ткани. Метод тканевых культур разработан Дж. Эндерсом в 50-е годы. Большинство вирусов способно размножаться в культурах клеток. Для каждого вируса можно подобрать наиболее чувствительную культуру клеток.

Способы обнаружения (индикации) вирусов в тканевой культуре.

Вирусы можно обнаружить следующим образом.

1. По цитопатическому действию (ЦПД). В результате размножения вирусов в клетках происходят морфологические изменения клеток (вакуолизация цитоплазмы, деструкция митохондрий, округление клеток). Часть клеток погибает и отслаивается от стекла. Вместо сплошного монослоя остаются отдельные клеточные островки. ЦПД обнаруживают под микроскопом (´8). По ЦПД можно не только обнаружить, но и идентифицировать вирусы. Например, вирус полиомиелита вызывает мелкозернистую деструкцию клеток; аденовирусы вызывают образование скоплений клеток в виде виноградных гроздьев; вирус кори вызывает образование симпластов – многоядерных клеток.

2. Пообразованию включений. Включения - скопления вирусов в клетках. Они имеют различную форму и размеры. Их окрашивают по Романовскому-Гимзе или флюорохромами и наблюдают под микроскопом.

3. Погемадсорбции. Клетки, зараженные вирусами, могут адсорбировать эритроциты. Вирусы выходят на поверхность клеток и связывают эритроциты. Эритроциты добавляют к культуре и через некоторое время промывают физиологическим раствором. На поверхности клеток под микроскопом видны прилипшие эритроциты в виде разнообразных фигур;.

4. Пореакция гемагглютинации. Гемагглютинация - склеивание эритроцитов под влиянием вирусов. Эритроциты добавляют к культуральной жидкости. Если в ней есть вирусы, то эритроциты склеиваются.

5. По"цветной" реакции. Клетки культуры выращиваются на жидкой среде с индикатором (метиленовым красным). Индикатор изменяет цвет (с красного на желтый) под действием кислых продуктов метаболизма при росте нормальных клеток. Если клетки заражены вирусом, то нормальный метаболизм нарушается, кислые продукты не образуются и индикатор не изменяет цвет. Таким образом, признаком размножения вирусов в клетках культуры является сохранение красного цвета среды.

15 .Генетические рекомбинации у бактерий: трансформация, трансдукция и конъюгация. Плазмиды и их роль в формировании лекарственной устойчивости и патогенного потенциала бактерий.

Комбинативная (рекомбинация) связана с изменением сочетанием генов в результате внесения в генотип дополнительного генного материала. Рекомбинация осуществляется путем трансформации,трансдукции и конъюгации. В этих процессах участвуют клетка-донор (отдает гены) и клетка реципиент(принимает гены).

Трансформация(превращение,преобразование)-изменение свойств бактериальной клетки в результате того, что фрагмент ДНК клетки-донора проникает в геном родственной бактерии. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов и др.

Трансдукция-перенос генетического материала от клетки-донора к клетки-реципиенту с помощью фага. При попадание фага в клетку его нуклеиновая кислота встраивается в состав бактериальной хромосомы. При выщеплении фаговой ДНК из хромосомы возможен захват небольшого количества соседствующих генов с последующим переносом в новую бактериальную клетку. Различают неспецифическую (перенос любого фрагмента ДНК донора) и специфическую (перенос определенного фрагмента ДНК донора в определенный участок ДНК реципиента) трансдукцию. Трансдукция способствует формированию бактерий с новыми свойствами,более приспособленными к окружающей среде.

Конъюгация (соединение)-передача генетического материала от клетки к клетки осуществляется при непосредственном контакте бактерий.Способность к конъюгации связана с наличием полового фактора F (F-плазмид), который контролирует образование половых F-пилей (половые ворсинки).Их роль заключается в сближении с клеткаи реципиента и образовании цитоплазматического мостика,через который передается информация от донора к реципиенту, т. е. происходит односторонняя передача.

Плазмида-кольцевая молекула ДНК,по размерам составляет 1-3 процента генома бактерии. Эта малая часть кодирует важные генетические признаки, которые сама бактериальная хромосома не обуславливает. Количество плазмид в одной клетки может колебаться от одной до сотни. Существуют плазмиды(не связанные с хромосомой) и интегрированные (встроенные в хромосому). По функциям их делят на регуляторные(компенсируют дефекты бактериальной клетки путем встраивания в геном и восстановления функций) и кодирущие –дают клетки новую генетическую информацию (свойства, необходимые для конъюгации клеток(F-плазмиды)),устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды) синтез энтеротоксина, выработку колицинов.Плазмиды обладают трансмиссивностью – способностью передаваться от клетки к клетке при генетическом обмене.

16. Понятие о биотехнологии. Использование методов генной инженерии для получения лечебных, диагностических и профилактических препаратов.

Биотехнология как наука является важнейшим разделом современной биологии, которая, как и физика, стала в конце ХХ в. одним из ведущих приоритетов в мировой науке и экономике.

Современная биотехнология – это наука о генно – инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства или получения новых видов продуктов различного назначения.

В рамках изучаемого курса можно выделить 3 основных части:

1. Промышленная биотехнология, где рассматриваются общие принципы осуществления биотехнологических процессов, происходит знакомство с основными объектами и сферами применения биотехнологии, рядом крупномасштабных промышленных биотехнологических производств, использующих микроорганизмы.

2. Клеточная инженерия. Основная цель этого раздела – знакомство с методами ведения культур клеток и практическим использованием этих объектов. В рамках этого раздела выделяют культивирование растительных клеток и методы культивирования животных клеток, так как подходы к культивированию этих объектов различаются в силу их принципиальных биологических различий.

3. Генная инженерия. Высшим достижением современной биотехнологии является генетическая трансформация, перенос чужеродных генов и других материальных носителей наследственности в клетки растений, животных и микроорганизмов, получение трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.

Особое значение имеет создание методами генной инженерии диагностических, лечебных и профилактических препаратов, ранее получаемых дорогостоящими методами. Чаще всего это продукты, выделяемые из крови иммунизированных доноров, - животных и людей. Технология получения гибридом основана на выделении от доноров клеток – продуцентов и их слияния с миеломными (опухолевыми) клетками. В результате образуется гибритная клетка – гибридома, способная быстро и бесконечно размножаться и подобным способом часто получают АТ. Предшественники гибридом – плазматические клетки, синтезирующие lg опеределенного типа. Поэтому получаемые продукты получили название моноклональных АТ. Наиболее часто применяют линии миеломных клеток мышей и крыс.частота слияний в смешанной культуре клеток (миеломных и донорских клеток – продуцентов) невелика – одна гибридома на 104 клеток.

Образовавшиеся гибридомы немедленно реклонируют, так как многие гибридные клетки склонны «выбрасывать» лишние хромосомы, пока их число не будет равным диплоидному набору (при этом гены, ответствееные за антителообразование, могут быть утрачены). Гибридомы создают не только на основе В – клеток, но и Т – лимфоцитов и многих других, секретирующих лимфокины, факторы роста и т.д. Продукты, полученные технологией гибридом, применяют для леченияи профилактики различных болезней, а также для изучения строения и функций различных молекул (например, клеточнх рецепторов). В частности, при при помощи гибридом получают моноклональные АТ, применяемые в иммуногистохимической диагностике опухолей.

Влияние температуры на микроорганизмы. Физические методы стерилизации. Однократные методы тепловой стерилизации. Аппаратура, режим, стерилизуемый материал. Контроль качества стерилизации в автоклаве и воздушном стерилизаторе.

Действие температуры на микроорганизмы.

Температура – важный фактор, влияющий на жизнедеятельность микроорганизмов. Для микроорганизмов различают минимальную, оптимальную и максимальную температуру. Оптимальная – температура, при которой происходит наиболее интенсивное размножение микробов. Минимальная – температура, ниже которой микроорганизмы не проявляют жизнедеятельности. Максимальная – температура, выше которой наступает гибель микроорганизмов.

По отношению к температуре различают 3 группы микроорганизмов:

1. Психрофилы (холодолюбивые). Оптимум – 10 - 15°С, максимум – 25-30°С, минимум – 0-5°С. Это обитатели почвы, морей, пресных водоемов (сапрофиты) и некоторые паразиты: паразиты холодолюбивых животных, некоторые виды иерсиний, клебсиелл, псевдомонад, вызывающих заболевания у человека.

2. Мезофилы. Оптимум – 30-37°С. Минимум – 15-20°С. Максимум – 43-45°С. Обитают в организме теплокровных животных. К ним относятся большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

3. Термофилы. Оптимум – 50-60°С. Минимум - 45°С. Максимум - 75°С. Обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна. Они не способны размножаться в организме теплокровных животных, поэтому не имеют медицинского значения.

Благоприятное действие оптимальной температуры используется при выращивании микроорганизмов с целью лабораторной диагностики, приготовления вакцин и других препаратов.

Тормозящее действие низких температур используется при хранении продуктов и культур микроорганизмов в условиях холодильника. Низкая температура приостанавливает гнилостные и бродильные процессы. Механизм действия низких температур – затормаживание в клетке процессов метаболизма и переход в состояние анабиоза.

Губительное действие высокой температуры (выше максимальной) используетсяпри стерилизации. Механизм действия – денатурация белка (ферментов), повреждение рибосом, нарушение осмотического барьера. Наиболее чувствительны к действию высокой температуры психрофилы и мезофилы. Особую устойчивость проявляют споры бактерий.

Стерилизация – это процесс полного уничтожения в объекте всех жизнеспособных форм микробов, в том числе спор.

Физические методы: стерилизация высокой температурой, Уф облучением, ионизирующим облучением, ультразвуком, фильтрованием через стерильные фильтры.

Стерилизация паром под давлением.

Наиболее эффективный и широко применяемый в микробиологической и клинической практике метод.

Метод основан на гидролизующем действии пара под давлением на белки микробной клетки. Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает высокую эффективность этой стерилизации, при которой погибают самые стойкие споровые бактерии.

Аппаратура – автоклав. Автоклав состоит из 2-х металлических цилиндров, вставленных друг в друга с герметически закрывающейся крышкой, завинчивающейся винтами. Наружный котел – водопаровая камера, внутренний – стерилизационная камера. Имеется манометр, паровыпускной кран, предохранительный клапан, водомерное стекло. В верхней части стерилизационной камеры – отверстие, через которое пар проходит из водопаровой камеры. Манометр служит для определения давления в стерилизационной камере. Между давлением и температурой существует определенная зависимость: 0,5 атм - 112°С, 1-01,1 атм – 119-121°С, 2 атм - 134°С. Предохранительный клапан – для защиты от чрезмерного давления. При повышении давления выше заданного, клапан открывается и выпускает лишний пар. Порядок работы. В автоклав наливают воду, уровень которой контролируют по водомерному стеклу. В стерилизационную камеру помещают материал и плотно завинчивают крышку. Паровыпускной кран открыт. Включают нагрев. После закипания воды кран закрывают лишь тогда, когда будет вытеснен весь воздух (пар идет непрерывной сильной сухой струей). Если кран закрыть раньше, показания манометра не будут соответствовать нужной температуре. После закрытия крана, в котле постепенно повышается давление. Начало стерилизации – тот момент, когда стрелка манометра показывает заданное давление. По истечении срока стерилизации прекращают нагрев и охлаждают автоклав до возвращения стрелки манометра к 0. Если выпустить пар раньше, жидкость может вскипеть из-за быстрой смены давления и вытолкнуть пробки (стерильность нарушается). Когда стрелка манометра вернется к 0, осторожно открывают паровыпускной кран, спускают пар и затем вынимают стерилизуемые объекты. Если не выпустить пар после возвращения стрелки к 0, вода может конденсироваться и смочить пробки и стерилизуемый материал (стерильность нарушится).

Материал и режим стерилизации:

а) стеклянная, металлическая, фарфоровая посуда, белье, резиновые и корковые пробки, изделия из резины, целлюлозы, древесины, перевязочный материал (вата, марля) (119 - 121°С, 20-40 мин));

б) физиологический раствор, растворы для инъекций, глазные капли, дистиллированная вода, простые питательные среды - МПБ, МПА(119-121°С, 20-40 мин);

в) минеральные, растительные масла в герметически закрытых сосудах (119-121°С, 120 мин);

18. Методы дробной тепловой стерилизации. Аппаратура, режим, стерилизуемый материал. Пастеризация. Влияние биологических факторов на микроорганизмы.

Действие биологических факторов на микроорганизмы.

Биологические факторы – это различные формы влияния микробов друг на друга, а также действие на микроорганизмы факторов иммунитета (лизоцим, антитела, ингибиторы, фагоцитоз) во время их пребывания в макроорганизме. Совместное существование различных организмов – симбиоз. Выделяют следующие формы симбиоза.

Мутуализм – такая форма сожительства, когда оба партнера получают взаимную выгоду (например, клубеньковые бактерии и бобовые растения).

Антагонизм – форма взаимоотношений, когда один организм наносит вред (вплоть до гибели) другому организму своими продуктами метаболизма (кислоты, антибиотики, бактериоцины), благодаря лучшей приспособленности к условиям среды, путем непосредственного уничтожения (например, нормальная микрофлора кишечника и возбудители кишечных инфекций).

Метабиоз – форма сожительства, когда один организм продолжает процесс, вызванный другим (использует его продукты жизнедеятельности), и освобождает среду от этих продуктов. Поэтому создаются условия для дальнейшего развития (нитрифицирующие и аммонифицирующие бактерии).

Сателлизм – один из сожителей стимулирует рост другого (например, дрожжи и сарцины вырабатывают вещества, способствующие росту других, более требовательных к питательным средам, бактерий).

Комменсализм – один организм живет за счет другого (извлекает выгоду), не причиняя ему вреда (например, кишечная палочка и организм человека).

Хищничество – антагонистические взаимоотношения между организмами, когда один захватывает, поглощает и переваривает другой (например, кишечная амеба питается кишечными бактериями).

Паразитизм – форма антагонистических отношений, когда один организм использует другой для обеспечения своей жизнедеятельности как источник питания и среду для обитания с причинением ему вреда (например, бактериофаги – паразиты бактерий).

Стерилизация текучим паром.

Метод основан на бактерицидном действии пара (100°С) в отношении только вегетативных клеток.

Аппаратура – автоклав с незавинченной крышкой или аппарат Коха.

Аппарат Коха -это металлический цилиндр с двойным дном, пространство в котором на 2/3 заполнено водой. В крышке – отверстия для термометра и для выхода пара. Наружная стенка облицована материалом, плохо проводящим тепло (линолеум, асбест). Начало стерилизации – время от закипания воды и поступления пара в стерилизационную камеру.

Материал и режим стерилизации. Этим методом стерилизуют материал, который не выдерживает температуру выше 100°С: питательные среды с витаминами, углеводами (среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина), желатином, молоко.

Влияние излучения, ультразвука и высушивания на микроорганизмы. Нетепловые физические методы стерилизация (УФ- лучи, ионизирующее излучение, ультразвук). Аппаратура, режим, стерилизуемый материал. Лиофильное высушивание и его использование.

Высушивание из замороженного состояния в вакууме- лиофилизация. Ее используют для сохранения культур микроорганизмов, которые в таком состоянии годами (10 – 20 лет) не теряют жизнеспособности и не меняют свойства. Микроорганизмы при этом находятся в состоянии анабиоза.

Метод лиофилизации используют в производстве живых вакцин против туберкулеза, чумы, туляремии, бруцеллеза, гриппа и др. болезней, в производстве пробиотиков.

Различают неионизирующие излучение (ультрафиолетовые и инфракрасные лучи солнечного света) и ионизирующие излучение (гамма – излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий).

Ионизирующее излучение обладает мощным проникающим и повреждающим клеточный геном действием. Но летальные для микроорганизмов дозы на несколько порядков выше, чем для животных и растений.

Рентгеновские лучи (длины волн менее 10 нм.) вызывают ионизацию макромолекул в живых клетках. Возникающие фотохимические изменения сопровождаются развитием мутаций или гибелью клетки.

Повреждающее действие УФ – излучения в большей мере выражено для микроорганизмов, чем для животных и растений. УФ – лучи в относительно небольших дозах вызывают повреждения ДНК микробных клеток.

Ультрафиолетовые лучи вызывают образование димеров тимина в молекуле ДНК, что подавляет репликацию ДНК, прекращает деление клетки и служит основной причиной ее гибели.

Ультразвук (волны с частотой 20000 Гц) обладает бактерицидными свойствами. Механизм его бактерицидного действия в том, что в цитоплазме бактерий образуется кавитационная полость, которая заполняется парами жидкости, возникает давление 10000 атм., что приводит к образованию высокореактивных гидроксильных радикалов, к дезинтеграции цитоплазматических структур, деполимеризации органелл, денатурации молекул. УФ – лучи, ионизирующее излучение, ультразвук используют для стерилизации различных объектов.

Стерилизация с помощью УФ – лучей основана на бактерицидном действии УФ – лучей с длиной волны 260 – 300нм.

Ее используют для обеззараживания воздуха лечебных учреждений, аптек, бактериологических боксов, лабораторий, цехов, заводов, детских учреждений; продуктов питания, питательных сред, посуды. Это метод холодной стерилизации не изменяет качество продуктов, т.к. в малых дозах не нарушает целостность макромолекул белков, витаминов, ферментов, полисахаридов. В последнее время ультрафиолетовое облучение входит практику обработки биологических препаратов – вакцин, сывороток.

При стерилизации прозрачных растворов термолабильных веществ (некоторых белков, витаминов, антиботиков) их наливают в посуду из кварцевого стекла тонким слоем и периодически стряхивают, т.к. УФ – лучи обладают слабой проникающей способностью.

Для этой стерилизации используют бактерицидные лампы БУВ – 15, БУВ – 30.

Ионизирующее излучение используют для стерилизации объектов, не выдерживающих термических и химических способов обработки: одноразовую пластиковую микробиологическую посуду, питательные среды, перевязочные материалы, некоторые лекарственные препараты (антибиотики, гормоны, вакцины, сыворотки), системы для переливания крови, шприцы, зонды, катетеры, хирургический инструментарий.

В качестве источника гамма – лучей используют Со 60. Преимущество этого вида стерилизации в том, что он может быть включен в непрерывный производственный процесс, он не меняет качества продукта, не вызывает денатурации его составных частей. Но необходим контроль остаточной радиации изделий.

Бактерицидными свойствами обладает ультразвук с частотой волн 20000 Гц.

В настоящее время ультразвуковые датчики используют для стерилизации пищевых продуктов (питательная ценность которых при этом максимально сохраняется), при изготовлении вакцин и стерилизации некоторых объектов (лабораторного оборудования), которые портятся при действии повышенной температуры и химической стерилизации.