Доклиническое исследование озонированной эмульсии на основе гинодиксина и рыбьего жира

Николаев С.В., Бледных Л.В., Конопельцев И.Г.

ФГБОУ ВО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия»

г. Киров

Нарушение воспроизводительной функции крупного рогатого скота в настоящее время составляет основную проблему дальнейшего развития молочного скотоводства. Одной из причин, вызывающих бесплодие и снижающих темпы воспроизводства стада, являются послеродовые осложнения, среди которых наиболее чаще диагностируются послеродовой острый эндометрит [1,2]. Острое воспаление эндометрия у коров, в основном, проявляется как осложнение течения послеродового периода вследствие эндо- или экзогенного инфицирования слизистой оболочки матки условно-патогенной микрофлорой (бактериями, грибами и т.д.) [3].

Несмотря на большое количество антимикробных препаратов, применяемых при лечении больных эндометритом животных, в связи с возросшими требованиями к молоку и все чаще встречаемой устойчивостью возбудителей, на первое место выходит поиск новых лекарственных средств, отвечающих требованиям безопасности, обладающих широким диапазоном антимикробного действия, а так же не оказывающих негативного влияния на слизистую оболочку матки [2,5].

В последние годы в медицине активно развивается и внедряется в практику методики по применению медицинского озона, в ветеринарии же это направление требует дальнейшего совершенствования. В связи с этим, разработка, апробация и внедрение в производство озонотерапии коров с акушерско - гинекологической патологией является в настоящее время актуальной проблемой, решение которой, представляет собой важную научно – практическую задачу [2,5].

В 2015 году на кафедре хирургии, акушерства и заразных болезней Вятской ГСХА была разработана озонированная эмульсия на основе гинодиксина и рыбьего жира обладающая высокой антимикробной активностью в отношении основных возбудителей послеродового эндометрита у коров. Исследования на острую и хроническую токсичность разработанного препарата показали, что в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 данный препарат относится к 4 классу токсичности (ЛД₅₀ более 1000 мг/кг), и характеризуется как малотоксичный. Тем не менее, перед началом клинических испытаний разработанной озонированной эмульсии в качестве этиотропного средства для лечения и профилактики эндометрита у коров, необходимо проверить, оказывает ли данный препарат аллергизирующее и раздражающего действия на организм животных, а так же провести исследования по изучению влиянию препарата на скорость регенерации поврежденных тканей.

Цель работы – изучение аллергезирующего и раздражающего действия озонированной эмульсии, а так же влияния данного препарата на скорость заживления ран.

Материалы и методы исследования. Исследования аллергизирующего и раздражающего действия озонированной эмульсии проводились в лаборатории кафедры хирургии, акушерства и заразных болезней Вятской ГСХА, исследования по влиянию препарата на скорость заживления ран и микробиологические исследования в ЗАО Агрофирма «Дороничи» (г. Киров).

Озонированную эмульсию получали путем смешивания 800 мл гинодиксина и 200 мл рыбьего жира (СТО 32896222-0011 – 2007) с добавлением 0,5 мл эмульгатора Твин 80. Эмульсию барботировали озоно-кислородной смесью посредствам керамического распылителя, с концентрацией озона на выходе 25-30 мг/литр и скоростью подачи кислорода 1,5 – 2 литра в минуту в течение 3х часов. Для получения озона использовали сертифицированный медицинский генератор озона «А-с-ГОКСф-5-02-ОЗОН» (МАЮИ 941714.004 ТУ) производства ОАО «Электромашиностроительный завод им. ЛЕПСЕ» г. Киров.

Раздражающее действие озонированной эмульсии исследовали на трех половозрелых кроликах породы шиншилла, путем аппликации препарата на конъюнктиву глаза. Для этого кроликам массой 1,5 – 2 кг под верхнее веко правого глаза наносили каплю свежеприготовленной озонированной эмульсии, левый глаз был контрольным, куда наносили каплю физиологического раствора. Учет реакции проводили через 5 минут, 1 час, 3, 5,10 часов, 24 часа, 48 часов и на 7 сутки.

Оценку аллергизирующего действия проводили согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Хабриев Р.У., 2005) на белых мышах-самцах в возрасте 2 месяцев со средней живой массой 20,7±2,3 грамм. Для изучения реакции замедленного типа было сформировано две группы животных – контрольная (n=6) и опытная (n=6). Сенсибилизацию мышей опытной группы проводили путем двукратного внутрибрюшинного введения озонированной эмульсии в дозе 0,1 мл с интервалом 1 сутки. Мышам контрольной группы внутрибрюшинно в такой же дозе и с таким же интервалом вводили физиологический раствор натрия хлорида. Через пять суток после заключительной инъекции животным обеих групп в подушечку одной задней лапы вводили разрешающую дозу озонированной эмульсии в объеме 0,05 мл (опытная лапа), а другой лапы 0,05 мл физиологического раствора (контрольная лапа). Спустя 24 часа мышей усыпляли эфиром, задние лапы ампутировали по уровню скакательного сустава и проводили их взвешивание с точностью до 0,00001 г. Уровень воспалительной реакции у животных каждой группы учитывали по индексу отека, который рассчитывали по формуле: И = (М_о - М_к) / М_к х 100, где М_о - масса опытной лапы, М_к - масса контрольной лапы.

Регенеративное действие препарата оценивали на разновозрастных выбракованных коровах (n=5) массой 600 – 750 кг. Эксперимент проводили с использованием планиметрического метода по Л.Н. Поповой (1942), суть которого состоит в определении характера и темпов ранозаживления путем регистрации скорости уменьшения площади раневой поверхности во времени. Для легкой седации, животным инъецировали 1% раствор ацепромазина из расчета 1 мл на 100 кг массы тела. В области холки выстригали шерсть, участок обрабатывали 70⁰ этиловым спиртом, проводили местную анестезию 0,5% новокаином, параллельно сагиттальной оси тела, на расстоянии 4-5 см от остистых отростков, скальпелем наносили 3 линейных разреза по трафарету, веретенообразной формы, 40×15 мм и глубиной 20 мм. Расстояние между разрезами было не менее 5 см. Каудальную рану обрабатывали озонированной эмульсией, а краниальную линиментом бальзамическим по Вишневскому один раз в день до полного заживления, медиальный разрез оставляли без обработки (контроль). На полиэтиленовой пленке маркером фиксировали контур раневой поверхности и измеряли ее площадь при помощи миллиметровой бумаги путем подсчета количества квадратных миллиметров внутри контура. Скорость заживления раневого дефекта за сутки в % рассчитывали по формуле: (S – Sn) × 100 / S × t, где S – площадь раны при предыдущем измерении; Sn – площадь раны при данном измерении; t – число дней между измерениями.

Для цитологического анализа, на 3 – 4 день, после нанесения ран на обезжиренные предметные стекла из раневого секрета делали мазки – отпечатки методом поверхностной биопсии. Полученные препараты фиксировали и окрашивали раствором краски Лейшмана в течение 3 минут, после чего краску смывали дистиллированной водой, мазки сушили на воздухе и микроскопировали. Для определения бактериальной обсемененности с раневой поверхности стерильными тупферами брали смывы и делали посевы на мясо - пептонный и желточно – солевой агар. Чаши Петри помещали в термостат, инкубировали в течении 24 часов при температуре 37⁰ С, после чего проводили визуальный подсчет колоний, определяли наличие гемолитических свойств у микроорганизмов.

Результаты исследований. Опыт по изучению местного раздражающего действия озонированной эмульсии показал, что у всех животных после аппликации данного препарата наблюдалось непродолжительная гиперемия и слезотечение, которые исчезали по истечению первого часа. При дальнейшем наблюдении за экспериментальными животными, каких либо отклонений обнаружено не было. Таким образом, мы установили, что озонированная эмульсия оказывает незначительное местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаза и носит кратковременный характер.

При изучении аллергизирующего действия разработанного препарата, средняя масса контрольной лапы (М_к) не сенсибилизированных мышей составила 129,11 ± 2,71 мг, сенсибилизированных 128,97±2,37 мг. Масса опытной лапы (М_о) не сенсибилизированных животных составила 159,95±3,22 мг, сенсибилизированных 168,82±6,67 мг. При постановке полученных значений в формулу И = (М_о - М_к) / М_к х 100, индекс отека у животных контрольной группы составил 23,96 ± 1,83, а у опытной 25,93 ± 1,62. Индекс отека лап у контрольной и опытной группы мышей как показывает исследования, не имеет достоверного отличия (Р>0,1).

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что уровень выраженности воспалительной реакции у животных контрольной и опытной группы почти одинаковы, что свидетельствует об отсутствии у данной препарата аллергезирующих свойств.

В эксперименте по влиянию озонированной эмульсии на скорость ранозаживления, исходная площадь контрольных ран в среднем составила 308,2±4,51 мм; ран обработанных линиментом по Вишневскому 323,0±8,79 мм; ран обработанных озонированной эмульсией 325,6±10,15 мм и не имела достоверной разницы. Струп с ран обработанных линиментом сходил в среднем на 20,2 ± 1,1 день, с ран обработанных озонированной эмульсией на 19,0±2,1 день, с не обработанных ран на 25,0 ±1,1 день. Площадь ран обработанных озонированной эмульсией после отхождения струпа была достоверно меньше (Р < 0,05) по сравнению с обработанными линиментом по Вишневскому и составила в среднем 41,0 ± 3,72 мм². При этом площадь обработанных линиментом ран после отхождения струпа составила 57,8 ± 3,77 мм², а не обработанных 49,8 ± 3,14 мм². Более быстрая контракция раны, наблюдалось при обработке озонированной эмульсией, что характеризовалось резким уменьшением площади раневого дефекта по отношению к исходному значению (на 87,4%), и была на 3,6% больше, в сравнении с необработанными ранами. Скорость заживления ран обработанных озонированной эмульсией составила 4,78 ± 0,41% в сутки, тогда как обработанных линиментом 4,19 ± 0,36%, а не обработанных 3,47 ± 0,14%. Процесс полной эпителизации ран обработанных озонированным препаратом занял в среднем 22,2 ± 1,86 дня, что на 6,8 дней меньше в сравнении с необработанными, и на 2 дня в сравнении с обработанными линиментом по Вишневскому.

При анализе мазков - отпечатков, взятых на 3-4 день после проведения операции с ран без антисептической обработки, на фоне бесструктурных масс, фрагментов клеток и деформированных эритроцитов располагались палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы (++++), единичные в поле зрения лимфоциты (+), тучные клетки (+), макрофаги (++), фибробласты (+), а также в большом количестве кокковая микрофлора (++++). Цитограммы мазков-отпечатков, взятых с поверхности ран обработанных озонированной эмульсией, и линиментом по Вишневскому, имели одинаковый характер: палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы (++), тучные клетки (+), макрофаги (++), фибробласты (++), микрофлора (+).

При бактериологическом исследовании смывов с поверхности ран, было установлено, что во всех пробах присутствует кокковая микрофлора, независимо от метода антисептической обработки, но при этом микрофлора, выделенная с не обработанных и обработанных линиментом по Вишневскому ран, обладает гемолитическими свойствами, а у бактерий, выделенных с ран обработанных озонированной эмульсией гемолитические свойства отсутствуют. Общее микробное число в смывах с ран, обработанных эмульсией в среднем составило 227 КОЕ, что в 19 раз меньше по сравнению с результатами смывов с необработанных ран и 2,7 раз меньше с ран обработанных линиментом.

Таким образом, результаты проведенных исследований по влиянию данного препарата на скорость ранозаживления показывают, что озонированная эмульсия обладает выраженными регенеративными свойствами, а так же антимикробным действием в отношении возбудителей раневой инфекции.

Выводы. Исходя из проведенных исследований, можно сделать вывод, что разработанная озонированная эмульсия не обладает аллергизирующим действием на организм экспериментальных животных, а раздражающее действие данного препарата носит незначительный и кратковременный характер. Позитивное влияние на процессы ранозаживления и высокая антимикробная активность озонированной эмульсии является экспериментальным обоснованием для проведения дальнейших исследований по определению эффективности применения озонированной эмульсии в качестве этиотропного средства для профилактики и лечения послеродового эндометрита у коров.

Список литературы:

1. Конопельцев И.Г. Озонотерапия и озонопрофилактика воспалительных заболеваний и функциональных расстройств матки у коров:Автореф. дис....д-равет. наук. Воронеж, 2004;40.

2. Муравина Е.С. Разработка и эффективность способа терапии больных послеродовым эндометритом коров с применением озонированной эмульсии: Дис… канд. вет. наук.Воронеж, 2013;149.

3. Скоморова М.Н. Терапевтическая эффективность гинодиксина при эндометритах и маститах коров, вызванных условно - патогенной микрофлорой: Автореф. дис…канд. вет. наук. Воронеж, 2013; 40.

4. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/Р.У. Хабриев. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. – 832 с.

5. Чучалин С.Ф.Применение озонированного оливкового масла при послеродовом эндометрите у коров-первотёлок: Автореф. дис. … канд. вет. наук. Воронеж, 2004; 20.

PRECLIKAL STUDY OZONATED EMULSION GINODIKSINA BASIS AND FISH OIL

Nikolaev S.V. Blednyh L.V. Konopeltsev I.G.

Ключевые слова: озонированная эмульсия, коровы – первотелки, аллергизирующий, раздражающий, регенерация.

Приведены результаты испытания озонированной эмульсии на наличие аллергизирующего и раздражающего действия, а так же влияния данного препарата на скорость заживления ран. Установлено, что озонированная эмульсия не обладает аллергизирующим действием, а ее раздражающие свойства не значительные и кратковременные. Так же озонированная эмульсия способствует более быстрому заживлению ран.

Key words: ozonated emulsion, cow - heifers, allergenic, irritant, regeneration.

The results testing ozonated emulsion for the presence of allergenic and irritating, as well as the influence of the drug on the rate of wound healing. It was established that the ozonated emulsion has no allergenic effect, and its irritating properties are not significant and short-term. Just ozonated emulsion promotes faster healing of wounds.

Заявка автора