Наследственные болезни - результат дефектов в генотипе, многообразие и распространенность. Наследственная предрасположенность к некоторым болезням (биохимические основы)

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ

Причиной наследственных болезней являются изменения (мутации) ДНК. В ре­зультате появляются аллельные варианты белков, которые могут различаться по функциональной способности. Например, HbS хуже выполняет функцию транс­порта кислорода, чем НЬА. Если функция белка нарушена существенно, то «пло­хой» аллель проявляется как наследственная болезнь (наследственная протеино-патия). По механизму возникновения наследственные болезни можно разделить на две группы. Наследственная болезнь может возникнуть в результате мутации, которая произошла в гаметах или зиготе, давших начало данной особи. Это пер­вая группа наследственных болезней, первичные мутации. Если первичная мута­ция нелетальна до репродуктивного возраста, то мутантный аллель может переда­ваться последующим поколениям и тоже проявляется как болезнь. Это вторая группа наследственных болезней.

В результате первичной генной мутации возникает гетерозиготность по дан­ному локусу, поскольку одновременное повреждение сразу двух гомологичных локусов диплоидной клетки маловероятно. В гетерозиготном состоянии «плохой» аллель часто (но не всегда) не проявляется как болезнь или бывает причиной бо­лезни, не слишком существенно снижающей жизнеспособность. Поэтому такие аллели могут сохраняться и распространяться в популяции. У родителей, каждый из которых является носителем мутантного аллеля в гетерозиготном состоянии, могут родиться дети, гомозиготные по такому аллелю: в этом случае развивается болезнь, нередко тяжелая.

Вернемся еще раз к серповидноклеточной анемии. В крови гомозигот SS име­ется только HbS. Поскольку эритроциты, содержащие HbS, менее стабильны, чем эритроциты с НЬА, у таких гомозигот скорость разрушения эритроцитов больше, и наступает анемия. Серповидноклеточная анемия проявляется в общей слабости, отставании развития, желтухе; больные обычно умирают в раннем детском возра­сте. Как же такой вредный для отдельных индивидов аллель сохраняется в популя­ции, не элиминируется отбором? Дело в том, что для популяции в целом его нельзя назвать вредным. Гетерозиготы AS имеют в эритроцитах и НЬА, и HbS; они прак­тически здоровы или у них обнаруживаются слабые признаки болезни. С другой стороны, в эритроцитах гетерозигот хуже развивается малярийный плазмодий, и они не заболевают малярией или легко переносят ее. Вот почему в местностях, где распространена малярия, частота аллеля S велика — до 35 %. Та­ким образом, ген серповидноклеточности, когда-то возникший в результате мута­ции, приводит к гибели части людей (гомозигот) от серповидно-клеточной ане­мии (до миллиона детей ежегодно), но популяция в целом приспособлена к среде, где важным фактором отбора является малярийный плазмодий. После ликвида­ции малярии аллель S начнет исчезать из генофонда людей.

Тяжесть наследственной болезни зависит от степени повреждения функции мутантного белка по сравнению с нормальным. Например, HbC бета6Glu->Lys) по свойствам мало отличается от НЬА; даже гомозиготы СС практически здоровы или страдают легкими формами анемии. Конечно, тяжесть болезни зависит и от важности функции, выполняемой данным белком. Частота каждой в отдельности наследственной болезни невелика, однако общая частота существенна и достига­ет 2-4 %. В настоящее время известны тысячи разных наследственных болезней; биохимическая природа многих из них остается неизученной.

Выше речь шла о болезнях, наследственная природа которых ясно выражена: они являются моногенными и наследуются в соответствии с правилами Менделя. Кроме того, возможна полигенная наследственная (семейная) предрасположенность к болезням. Такие распро­страненные болезни, как атеросклероз, сахарный диабет, подагра, язва желудка, шизофрения, эпилепсия, имеют полигенную природу. Между наследственными болезнями и болезнями, вызванными факторами среды, нет резкой границы. Например, появление анемии при наследова­нии гемоглобина S практически не зависит от среды. С другой стороны, болезни вследствие травм, отравлений, инфекци­онные болезни и т. д. мало зависят от наследственности. Здесь речь идет о восприимчивости к повреждающим агентам среды. Одна­ко дальнейшее развитие болезни всегда зависит от инди­видуальных особенностей генотипа. Например, раны у од­них людей заживают быстрее, у других — медленнее.

Между крайними формами болезней — наследственными и вызванными фак­торами среды — имеется непрерывный ряд промежуточных форм.

Примером такой промежуточной формы может быть эмфизема легких, свя­занная с недостаточностью aльфаl-антитрипсина. Белок сыворотки крови альфаl-анти-трипсин является ингибитором некоторых протеолитических ферментов. Он участвует в регуляции воспалительной реакции. Некоторые аллельные варианты этого белка обладают сниженной ингибиторной способностью. Индивиды, гомо­зиготные по таким аллелям, предрасположены к возникновению эмфиземы лег­ких, которая обычно развивается в возрасте 40-50 лет. Если эти индивиды под­вергаются раздражающим ингаляциям (производственные или бытовые загрязне­ния воздуха, курение), то эмфизема развивается раньше. Больше того, при этих условиях эмфизема возникает и у гетерозигот по данному аллелю, в то время как при обитании в условиях чистого воздуха они остаются здоровыми.

Таким образом, «плохой» аллель может существовать в скрытом состоянии и обнаруживает себя лишь при определенных условиях. Особенно выразитель­но это проявляется в случаях индивидуальной непереносимости некоторых лекарственных веществ. Рассмотрим реакцию на дитилин людей с разными алле­ломорфами холинэстеразы плазмы крови. Этот фермент сходен с ацетилхолинэс-теразой нервной ткани, но отличается от нее более широкой субстратной специфичностью: он гидролизует не только ацетилхолин, но и некоторые другие эфиры, в том числе дитилин. Напомним, что дитилин применяется как миорелаксант при некоторых хирургических операциях и эндоскопических обсле­дованиях, например при бронхоскопии. Действие дитилина в применяемых дозах обычно непродолжительно — несколько минут. Это связано с тем, что он быстро разрушается холинэстеразой плазмы. Однако в редких случаях (примерно у одного пациента из 2000) паралич мышц продолжается часами: чтобы спасти жизнь боль­ного, его приходится все это время держать на искусственном дыхании. Оказалось, что у таких людей активность холинэстеразы плазмы крови значительно ниже, чем обычно; низкая активность обнаруживается и у родственников этих людей. Следова­тельно, имеются аллельные формы фермента; они различаются не только по ак­тивности, но и по другим свойствам, в частности по электрофоретической подвиж­ности. Индивиды с низкой активностью холинэстеразы плазмы совершенно здоро­вы, аллельный ген обнаруживает себя лишь при введении дитилина.

Непереносимость дитилина — это следствие ясно выраженного наследствен­ного дефекта.. В целом непереноси­мость дитилина в равной мере зависит от генетического дефекта и внешнего фак­тора. Большее значение имеют генетические дефекты, проявляющиеся как непереносимость некоторых пищевых веществ, поскольку пищевые вещества, в отличие от лекарств, потребляются всеми людьми и постоянно.

У некоторых взрослых людей наблюдается постоянная непереносимость лак­тозы: молоко и молочные продукты вызывают у них газообразование в кишечни­ке, боли в животе и понос. Непереносимость обусловлена отсутствием в кишеч­нике фермента лактазы.

Лактаза содержится в кишечнике новорожденных и обеспечивает усвоение лактозы грудного молока, расщепляя ее на глюкозу и галактозу. Ко времени пре­кращения грудного вскармливания или немного позднее активность лактазы в кишечнике заметно снижается, а у некоторых детей исчезает полностью. Лактаза отсутствует примерно у 15 % взрослых людей европейских народностей и у 80 % восточных народностей, негров, индейцев Америки. Непереносимость наследует­ся как простой доминантный признак. Генетический дефект не связан с повреж­дением гена лактазы, поскольку в грудном возрасте фермент синтезируется. Оче­видно, имеются аллеломорфы какого-то белка, участвующего во включении и выключении гена лактазы в ходе онтогенеза. Отметим, что молоко стало обыч­ной пищей для взрослых лишь с того времени, когда человек научился разводить молочный скот; с этого времени и могло начаться распространение в популяциях аллеля, который обеспечивал сохранение лактазы у взрослых людей.

Рассмотренные здесь примеры непереносимости лекарственных или пище­вых веществ представляют группу явлений того же рода, что и наследственная предрасположенность к болезням. Для диагностики наследственных болезней, обусловленных генными мутациями, часто используют ДНК-зонды, аналогично ДНК-диагностике серповидно-клеточной анемии, описанной в начале этой главы.

Международная исследовательская программа "Геном человека". Банки генетических данных. Биоинформатика. Митохондриальная ДНК и ДНК Y-хромосомы как объекты исследования в эволюционной и популяционной генетике.

ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА

Размеры генома человека

Напомним, что соматические клетки человека содержат диплоидный набор хро­мосом — 22 пары аутосомных и одну пару половых: XX — у женщин и XY — у муж­чин, всего 46 хромосом. В яйцеклетках и сперматозоидах содержится гаплоидный набор — 23 хромосомы. Из них 22 хромосомы одинаковые у мужчин и женщин (аутосомные хромосомы), а 23-я хромосома X — у женщин и Y — у мужчин. Ауто-сомные хромосомы нумеруются от 1 до 22 в порядке уменьшения размера.

Общая длина всех молекул ДНК гаплоидного набора составляет 3*10⁹ н. п., или 1 м. Полная запись генома человека с использованием однобуквенных симво­лов (AGCAAT...) заняла бы около 1000 томов по 1000 страниц каждый и 3000 зна­ков на странице. В каждой хромосоме содержится одна молекула ДНК. В хромо­соме 21 (самая маленькая хромосома в геноме человека) молекула ДНК содержит 50 000 000 н. п., длина ее равна 1,5 см. Длина молекулы ДНК в хромосоме средне­го размера равна примерно 130 000 000 н. п., или 4 см (в записи однобуквенными символами — 45 томов).

Небольшое количество ДНК содержится в митохондриях — меньше 1 % от всей ДНК. Митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии, посколь­ку митохондрии сперматозоидов не проникают в яйцеклетку

Геном Е. coli в 1000 раз меньше генома человека (один том однобуквенной записи).

Генами называют участки ДНК, кодирующие синтез тРНК, рРНК и мРНК. Гены, кодирующие синтез мРНК, называют также генами белков. На их долю приходится лишь около 10 % всей ДНК клетки (100 томов однобуквенной запи­си). Регуляторные последовательности занимают не много места. Функции ос­тальной ДНК (почти 90 %) большей частью неизвестны; значительная часть ее представлена многократно повторяющимися, тандемно расположенными нукле-отидными последовательностями.

Для каждой из 60-ти индивидуальных тРНК имеется от 10 до 20 копий гена. Гены рРНК образуют тандемы повторяющихся звеньев, каждое из которых содер­жит нуклеотидные последовательности, кодирующие 28S-, 18S- и 5,8S- рРНК. Чис­ло таких повторов в геноме человека равно примерно 160-ти. Располагаются они в области ядрышковых организаторов пяти пар хромосом — 13, 14, 15, 21 и 22. Гены 5S-pPHK находятся на хромосоме 1, образуя тандем примерно из 2000 генов.

Число разных генов мРНК, т. е. генов, кодирующих разные белки, в клетках человека около 50 000. В гаплоидном наборе некоторые из индивидуальных генов мРНК представлены единственной копией, другие — двумя или несколькими копи­ями, и есть такие, число копий которых исчисляется сотнями (например, гены ги-стонов). Гены мРНК обычно имеют размеры в пределах 1000-1 000 000 н. п.

Библиотека ДНК человека

Одной из задач изучения генома является создание библиотеки ДНК человека. Под библиотекой ДНК подразумевают коллекцию клонированных (размножен­ных) фрагментов ДНК организма. Такими фрагментами могут быть гены, промо­торы, энхансеры, сайленсеры и др. Одновременно создаются две формы библио­теки: 1) геномная библиотека, содержащая копии всех без исключения участков (нуклеотидных последовательностей) генома; 2) библиотека комплементарной ДНК, содержащая только те последовательности, которые комплементарны ка­кой-либо из мРНК. Следовательно, эта библиотека не содержит регуляторных и других нетранскрибируемых последовательностей (напомним, что на их долю приходится около 90 % всей ДНК); кДНК не содержит также интронов. Полная библиотека генома человека является необходимой базой как для изучения функ­ционирования генов, так и для решения прикладных проблем, прежде всего ме­дицинских.

Технология рекомбинантных ДНК, конструирование химерных молекул ДНК и их клонирование. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) как методы изучения генома и диагностики болезней. Генная терапия.

Генная Инженерия.

Успехи биохимии привели к разработке методов, позволяющих манипулировать генами с целью изменения генотипа, а следовательно, и фенотипических призна­ков организма. Это направление исследований получило название генной инже­нерии. Основная цель таких исследований — научиться исправлять наследствен­ные дефекты генома, т. е. лечить наследственные болезни, а также создавать этим методом новые фенотипы путем прямой пересадки генов из одного организма в геном другого. Первые успехи генной инженерии связаны с получением новых форм микроорганизмов, синтезирующих полезные для человека продукты, в том числе лекарственные вещества.

Процедура пересадки гена включает следующие операции:

1) выделение гена;

2) получение рекомбинантной (гибридной) ДНК;

3) введение рекомбинантной ДНК в клетку (получается рекомбинантная клетка);

4) клонирование (размножение) рекомбинантной ДНК (рекомбинантных клеток).

Выделение гена.

Для выделения и клонирования (размножения) гена чаще всего применяют поли-меразную цепную реакцию (см. гл. 4). Еще один метод — синтез ДНК (гена) с ис­пользованием обратной транскриптазы. Напомним, что этот фермент есть в час­тицах некоторых РНК-содержащих вирусов. Обратная транскриптаза катализиру­ет синтез ДНК, используя в качестве матрицы РНК:

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты -» ДНК + Н₄Р₂0₇

Если при реакции in vitro с этим ферментом добавить в инкубационную смесь определенную мРНК (например, мРНК интерферона), то синтезируется ген, ком­плементарный этой мРНК, в котором закодирована структура соответствующего белка (например, интерферона). Многие индивидуальные РНК удается выделить из сложной смеси разных мРНК клетки и использовать для синтеза генов. Однако при этом методе получается, собственно, не ген, а так называемая комплементар­ная ДНК (кДНК): она отличается от гена тем, что не содержит интронов, посколь­ку при созревании мРНК участки, соответствующие интронам, удаляются.

ДНК, синтезированную с применением обратной транскриптазы, можно амп-лифицировать методом ПЦР.

Получение рекомбинантной ДНК.

Ген нужно ввести в клетку таким образом, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, а интегрировался с геномом клетки. Для этого in vitro ген соединяют с определенной ДНК, выполняющей роль проводника (вектора). Часто в качестве вектора используют плазмиды — небольшие кольцевые молекулы ДНК, содержа­щие несколько генов. В исследованиях по генной инженерии часто используют кишечную палочку Е. coli. Геном этой бактерии представлен одной хромосомой (молекулой ДНК), прикрепленной к мембране, и плазмидами, «плавающими» в цитозоле. Плазмида представляет собой кольцевую ДНК; она примерно в 1000 раз меньше основной молекулы ДНК. В клетке может быть несколько разных плаз-мид, и каждая из них может быть представлена большим числом копий (до не­скольких сотен). Репликация плазмид происходит независимо от репликации ос­новного генетического материала. Некоторые плазмиды могут включаться в хромосому и снова отделяться от нее. Плазмиды могут переходить из одной бак­териальной клетки в другую при конъюгации клеток.

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК. Для этого применяют рестрик-тазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в ре­зультате чего образуются «липкие» концы — неспаренные участки цепей, способ­ные присоединять комплементарные им полинуклеотиды. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, тоже создают «липкие» концы, используя ту же рест-риктазу, и, следовательно, на фрагменте ДНК образуются «липкие» концы, комп­лементарные «липким» концам рестриктированной плазмиды. Если теперь сме­шать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся «липкими» концами. Затем с помощью фермента лигазы образуют фосфодиэфирную связь между концевыми нуклеотидами обеих молекул, и вновь получают кольцевую моле­кулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК, т. е. ДНК, содержащая новую комби­нацию последовательностей (или генов), такую, какой прежде в природе не было.

Клонирование рекомбинантной ДНК.

Описанная выше процедура сложна и позволяет получать лишь очень небольшие количества рекомбинантной ДНК (рекомбинантных плазмид). Клонирование — это способ накопления, амплификации рекомбинантной ДНК.

Если к культуре Е. coli добавить рекомбинантные плазмиды, то они при опре­деленных условиях включаются в бактериальные клетки — получаются рекомби­нантные бактерии. Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже со­держат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий можно выделить клонирован­ные рекомбинантные плазмиды, а из них — исследуемый фрагмент ДНК: для этого рекомбинантные плазмиды обрабатывают той же рестриктазой, с помощью кото­рой они были созданы. Таким путем можно выделить ген или любой другой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей. Отметим, что этот результат вполне подобен результату, получаемому при исполь­зовании ПЦР: и в том и в другом случае происходит накопление исследуемой ДНК; по этой причине ПЦР часто называют молекулярным клонированием ДНК.

Применение рекомбинантных клеток для синтеза лек.средств.

Микроорганизмы — очень удобный объект для промышленного получения многих природных продуктов: они быстро размножаются (биомасса может удваиваться всего за полчаса), процессы выращивания и обработки биомассы технологичны, поддаются автоматизации. С развитием генной инженерии и техники рекомбинан-тных микроорганизмов появилась возможность заставить микроорганизмы синте­зировать нужные человеку вещества, которые получить другими методами сложн.

Например, интерферон для применения в качестве лекарства преж­де получали либо из лейкоцитов крови человека, либо из культуральной жидкости, в которой выращивают клетки человека, синтезирующие этот белок. Такие мето­ды очень дороги и не позволяют получать достаточные количества лекарства.

Если ввести в клетки Е. coli плазмиду, содержащую ген интерферона человека, то они начинают продуцировать интерферон — белок, который природные штам­мы бактерии не синтезируют. В настоящее время методами генной инженерии созданы также микроорганизмы, синтезирующие человеческие гормоны инсулин,

соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факто­ры свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней.

Амплификация (клонирование) фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции

Содержание ДНК в клетках невелико, а на долю одного фрагмента размером со средний ген приходится всего лишь около одной миллионной части всей ДНК клетки, и это создает значительные трудности для изучения генома. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет in vitro накопить необходимое количество иссле­дуемого фрагмента ДНК. Метод основан на реакции синтеза ДНК при действии ДНК-полимеразы, но эта реакция организована особым образом.

Проведение полимеразной цепной реакции

Реакция проходит в три стадии.

1. Инкубационную смесь нагревают до 90 °С. При этом происходит денатура­ция ДНК, из одной двухцепочечной молекулы образуются две одноцепо-чечные.

2. Инкубационную смесь охлаждают до 50 °С. При этом происходит гибриди­зация цепей с затравками.

3. Инкубационную смесь нагревают до 70 °С. При этой температуре гибрид­ные молекулы не денатурируются, а ДНК-полимераза удлиняет обе затрав­ки с их З'-концов до 5'-концов матричных цепей. В результате образуются две новые цепи ДНК, укороченные с 5'-концов; при этом затравка оказыва­ется включенной в эти укороченные цепи молекул ДНК.

Концентрация каждой затравки должна значительно превышать концентра­цию ДНК. В противном случае во время стадии 2 высока вероятность того, что разделенные цепи ДНК будут соединяться не с затравкой, а друг с другом. Кроме того, как уже отмечено, затравки остаются в составе вновь синтезированной ДНК, т. е. расходуются во время реакции.

Затем цикл смены температур повторяют. Во втором цикле происходят те же события, что и в первом, но кроме того используются в качестве матриц укоро­ченные цепи, образовавшиеся в первом цикле: эти цепи еще раз укорачиваются (с З'-концов), и образуются цепи, содержащие только последовательность нуклео-тидов искомого гена. В цик­ле 2 показаны превращения молекулы А, образовавшейся в цикле 1; аналогичным превращениям подвергается и молекула Б.

В следующем (третьем) цикле смены температур снова происходят те же со­бытия, что и в первых двух циклах, но кроме того используются в качестве матри­цы цепи, содержащие только последовательность нуклеотидов искомого гена; в результате получается двухцепочечная молекула (выделена штриховкой), содер­жащая только ген данного белка.

Далее цикл смены температур повторяют многократно, и в каждом цикле (на­чиная с четвертого) происходит репликация гена, т. е. удвоение его количества в инкубационной смеси. Реакция протекает быстро, каждый трехстадийный цикл занимает около трех минут, за один час можно провести 20 циклов. Количество ДНК нарастает в геометрической прогрессии со множителем 2: за п циклов оно будет равно 2п; за 20 циклов увеличится примерно в миллион раз.

Поскольку матрица при матричном синтезе не расходуется, то исходная ДНК, внесенная в инкубационную смесь, в каждом цикле используется для синтеза уко­роченных с 5'-конца цепей. Количество этих матриц на­растает, однако не в геометрической, а в арифметической прогрессии, и через 20 циклов увеличивается примерно в 20 раз, что ничтожно мало по сравнению с миллионнократным увеличением количества гена.

Высокая эффективность ПЦР позволяет накопить необходимое количество ДНК при очень малых исходных количествах — достаточно одной капли крови, одного волоса, даже одной клетки или одной молекулы ДНК. Метод ПЦР резко ускорил изучение генома человека, и нашел практическое применение для диаг­ностики болезней (ДНК-диагностика), а также для идентификации личности.

В частности, ПЦР применяют для диагностики инфекционных болезней. Тра­диционная диагностика таких болезней основана на использовании микробиоло­гических методов, которые часто требуют гораздо больше времени и менее надеж­ны, чем ДНК-диагностика. Метод основан на том, что первичная структура ДНК разных видов организмов различна. Следовательно, можно подобрать такие зат­равки, которые будут гибридизоваться с ДНК возбудителя, но не с ДНК человека. Если, используя эти затравки, провести ПЦР с материалом (кровь, биопсийный материал), полученным от больного, то нарастание количества ДНК в пробе бу­дет указывать на наличие возбудителя в организме пациента: в ПЦР будет синте­зироваться только ДНК возбудителя, а не пациента.

Вирусы, для которых характерен длительный латентный период (например, вирус иммунодефицита человека), трудно обнаружить на ранних стадиях разви­тия инфекции. С помощью ПЦР это удается сделать даже тогда, когда вирус содер­жится лишь в незначительной части клеток организма.