Оперонов, регулируемых по механизму индукции и репрессии

Регуляция действия генов

Регуляция на уровне транскрипции (образование первичного транскрипта) — наи­более распространенный механизм регуляции синтеза белков. Этот процесс ина­че называют регуляцией действия генов или регуляцией экспрессии белков. Раз­личают две формы регуляции: индукция синтеза (положительная регуляция) и репрессия синтеза (отрицательная регуляция). Понятия индукции и репрессии предполагают изменение скорости синтеза по отношению к некоторому исходно­му, базальному уровню. Синтез в базальном состоянии называют кон­ститутивным синтезом. Если скорость конститутивного синтеза некоторого бел­ка высока, то такой белок обычно регулируется по механизму репрессии синтеза, и наоборот — при низкой базальной скорости обычно бывает индукция синтеза. При промежуточной базальной скорости синтез белка может регулироваться и путем индукции, и путем репрессии.

Понятия «положительная регуляция» и «отрицательная регуляция» относятся также и к регуляции активности белка — ингибированию или активации уже име­ющегося белка.

Регуляция транскрипции у бактерий

Механизмы регуляции транскрипции у бактерий изучены достаточно хорошо. Эти примеры важны и для изучения биохимии животных, поскольку дают представле­ние об общих молекулярных основах регуляции действия генов.

Рассмотрим пример индукции синтеза белков. Кишечная палочка в качестве пищевого вещества может использовать дисахарид лактозу. Превращения лактозы в клетках Е. coli начинаются с гидролиза при участии (3-галактозидазы (лактазы):

Лактоза + Н20 -> Галактоза + Глюкоза

При выращивании Е. coli на среде без лактозы (3-галактозидаза в клетках обна­руживается в очень малых количествах. Если же в среду добавить лактозу, количе­ство фермента увеличивается в сотни раз за несколько минут, т. е. происходит индукция синтеза фермента.

Изучение молекулярных механизмов этого явления привело к созданию тео­рии оперона. Опероном называют отрезок ДНК, содержащий структурные гены определенных белков и регуляторные участки.

С участком оперона, называемым промотор, связывается РНК-полимераза. При ее движении по оперону происходит транскрипция структурных генов (3-га-лактозидазы, пермеазы, необходимой для транспорта лактозы в клетку, и галакто-зидтрансацетилазы. При этом получается одна молекула мРНК, содержащая мат­рицы для всех трех белков. Последующая трансляция этой мРНК ведет к образо­ванию указанных белков.

В результате транскрипции гена-регулятора образуется мРНК, служащая мат­рицей для синтеза белка-регулятора. Этот белок может присоединяться к опера­тору и тем самым блокировать транскрипцию структурных генов. Белок-регуля­тор может также соединяться с лактозой, при этом утрачивается его сродство к оператору

Если в среде есть лактоза, то белок-регулятор связан с ней, оператор свободен и возможна транскрипция — синтезируются белки, необходимые для усвоения лактозы. Если лактозы в среде нет, то белок-регулятор соединяется с оператором, транскрипции нет и белки, ненужные в этих условиях, не синтезируются. Биоло­гическая целесообразность такой регуляции очевидна: достигается экономия ве­ществ и энергии.

Обязательным условием этого механизма регуляции является нестабильность мРНК: после исчерпания лактозы в среде мРНК должна быть быстро разрушена, чтобы прекратился синтез ставших ненужными белков. Это происходит путем гидролиза мРНК под действием РНКаз. Время полужизни мРНК в клетках бакте­рий измеряется немногими минутами.

Примером регуляции путем репрессии синтеза может служить гистидиновый оперон бактерий Salmonella typhimurium. Этот оперон содержит 10 структурных генов, кодирующих 10 ферментов, необходимых для синтеза гистидина. Фермен­ты образуются только в том случае, когда в среде нет готового гистидина и клетки вынуждены сами синтезировать его из других веществ; добавление гистидина в среду прекращает синтез ферментов. Несмотря на противоположный результат индукции и репрессии синтеза белков, их молекулярные механизмы очень сход­ны. В действии гистидинового оперона легко разобраться, если на р вмес­то «в присутствии лактозы» поставить «в отсутствие гистидина», вместо «в отсут­ствие лактозы» — «в присутствии гистидина» и вместо 3 структурных генов лактозного оперона — 10 структурных генов, кодирующих ферменты для синтеза гистидина.

Роль энхансеров (усилителей) и селенсеров (тушителей), амплификации (увеличение копий) и перестройки генов, процессинга, транспорта из ядра в цитоплазму и изменение стабильности мРНК в регуляции синтеза белков у эукариотов - основа онтогенеза и специализации органов и тканей многоклеточного организма.

Регуляция действия генов у эукариот

В клетках эукариот от ДНК исходят сигналы, которые в конечном счете переда­ются РНК-полимеразе: стимулируют или подавляют инициацию синтеза РНК. Источником сигналов служат определенные локусы ДНК — регуляторные элемен­ты. Эти участки имеют небольшие размеры, порядка 10 н. п. Регуляторные элемен­ты, стимулирующие транскрипцию, называют энхансерами (англ. enhancer — уси­литель), а подавляющие транскрипцию — сайленсерами (англ. silencer — глуши­тель, успокоитель).

Регуляторные элементы могут избирательно соединяться с белками-регулято­рами.

Белки, соединяющиеся с энхансерами, называют индукторами, а соединяющи­еся с сайленсерами — репрессорами. Энхансеры, сайленсеры и белки-регулято­ры вместе называют цис-элементами:

□ Цис-элементы:

— Регуляторные элементы (локусы ДНК):

Энхансеры; Сайленсеры.

— Белки-регуляторы:

Индукторы (белки, узнающие энхансеры); Репрессоры (белки, узнающие сайленсеры).

□ Трансэлементы:

— Гормоны, метаболиты, ионы металлов, повышенная температура.

Цис-элементы действуют на гены только той молекулы ДНК, в которой они сами находятся. Энхансеры и сайленсеры могут располагаться вблизи от промо­тора и от стартовой точки транскрипции регулируемого гена, но могут быть и удалены от него, даже на тысячи нуклеотидных пар, как в сторону 5'-конца, так и в сторону З'-конца. Однако они могут быть сближены в результате изгибания мо­лекулы ДНК.

Белки-регуляторы (индукторы и репрессоры) содержат по крайней мере три домена:

1) домен, узнающий определенную нуклеотидную последовательность ДНК; эти домены часто имеют супервторичную структуру типов альфа-спираль-поворот-альфа-спираль, лейциновая застежка-«молния», цинковый палец;

2) домен, узнающий трансэлементы;

3) домен, взаимодействующий с факторами транскрипции в области ТАТА-последовательности; в результате этого белки-регуляторы влияют на транс­крипцию, а именно увеличивают (индукторы) или уменьшают (репрессоры) частоту инициации транскрипции.

Каждый ген регулируется независимо от других. Следовательно, для каждого гена существуют специфические регуляторные элементы (локусы ДНК) и специ­фические регуляторные белки, узнающие эти элементы. Уже известно много регуляторных белков и регуляторных элементов разных генов, и постоянно обнару­живаются все новые и новые.

Присоединение регуляторных белков к энхансерам или сайленсерам зависит от других веществ — трансэлементов, сигнальных молекул, приносимых в клетку с кровью или образующихся в самой клетке. К числу таких молекул относятся гор­моны, некоторые метаболиты, ионы металлов. Есть регуляторные белки, реаги­рующие на изменение температуры. Все эти сигналы стимулируют присоединение индукторов к соответствующим энхансерам или репрессоров к соответствующим сайленсерам. Трансэлементами их называют потому, что они могут действовать на любую молекулу ДНК (любую хромосому), если только в ней есть подходящий цис-элемент.

Чтобы разобраться в этой сложной системе и пока неустоявшейся терминоло­гии, рассмотрим конкретный пример — регуляцию синтеза металлотионеина. Металлотионеин — небольшой белок, содержащий много остатков цистеина, примерно 1/3от всех аминокислот, и поэтому способный связывать ионы тяже­лых металлов — Zn, Cu, Cd, Hg, Ag. Одна молекула металлотионеина связывает несколько ионов. Эти ионы токсичны для организма, и при избыточной концен­трации выводятся в комплексе с металлотионеином. Металлотионеин постоянно синтезируется в печени и секретируется в кровь, что важно для регуляции кон­центраций ионов Zn и Си, поскольку они являются нормальными и обязатель­ными компонентами организма. Но при повышенном поступлении в организм ионов тяжелых металлов синтез металлотионеина стимулируется (положитель­ная регуляция).

Не­подалеку от старта транскрипции и промотора ТАГА имеются энхансеры (девя-тинуклеотидные последовательности), узнаваемые специфическими регуляторными белками (индукторами), и GC-мотив — тоже короткая последовательность, узнаваемая регуляторными белками. Белки-индукторы взаимодействуют с энхансерами при повышении концентрации ионов металлов (на рисунке два таких энхансера) или кортизола. В результате конформационных изменений индукторы приобретают сродство к белкам, инициирующим транскрипцию, расположенным в ТАТА-области, и активируют инициацию транскрипции. Для контакта индукто­ров с белками области TATA необходимо изгибание молекулы ДНК.

Энхансеры промоторной области металлотионеина содержат девятинуклео-тидные последовательности TGCGCTCGG (или варианты этой последовательно­сти). Если такую последовательность включить в молекулу ДНК, содержащую ген Р-глобина, то синтез Р-глобина становится зависимым от ионов металлов.

Матричные РНК клеток животных — более долгоживущие молекулы, чем бак­териальные: время их жизни измеряется часами, днями, в некоторых случаях даже неделями. Поэтому большее значение приобретают механизмы регуляции на уров­не трансляции, при постоянной концентрации мРНК.

Изменение белкового состава клеток при дифференцировке. Синтез гемоглобина у человека на стадиях: эмбрион-плод-взрослый организм. Значение изучения дифференцировки и онтогенеза для медицины.

ИЗМЕНЕНИЯ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ОРГАНИЗМА

Общая концентрация белков в клетке, как правило, близка к 20 %, а в некоторых клетках заметно больше (например, в эритроцитах 35 %). В клеточных органеллах концентрация белков еще больше (например, в матриксе митохондрий около 40%).

Белковый состав организма взрослого здорового человека более или менее постоянен, однако возможны изменения содержания отдельных белков в зависи­мости от физиологической активности, состава пищи и режима питания, цикли­ческие изменения (биоритмы). В процессе развития организма, особенно на са­мых ранних стадиях (от зиготы до формирования дифференцированных органов со специализированными функциями), белковый состав изменяется значительно. В основе различий структуры и функции специализированных клеток лежат раз­личия их химического состава, прежде всего белкового. Например, эритроциты содержат гемоглобин, обеспечивающий транспорт кислорода кровью; мышечные клетки содержат сократительные белки актин и миозин; в клетках сетчатки глаза есть белок родопсин, способный улавливать фотоны, и т. д. Многие белки содер­жатся во всех или почти во всех клетках, но могут быть в разных количествах. При болезнях белковый состав тканей изменяется. Эти проявления болезней называ­ют протеинопатиями. Различают протеинопатии двух типов — наследственные и приобретенные.

Наследственные протеинопатии — результат первичного повреждения в ге­нетическом аппарате организма. При этом или какой-либо белок не образуется во­обще, или синтезируется измененный по структуре, «неправильный» белок. При­мером может служить серповидно-клеточная анемия (одна из гемоглобинопатии), при которой вместо НЬА образуется HbS, хуже выполняющий функцию транспор­та кислорода. Во многих случаях нарушение синтеза даже одного белка является фатальным для организма или приводит к тяжелой болезни. Например, индиви­ды, гомозиготные по HbS, погибают от малокровия в раннем детском возрасте.

Приобретенные протеинопатии, по-видимому, сопровождают любую из болез­ней, однако в клинической практике имеют значение лишь достаточно выражен­ные случаи. При приобретенных протеинопатиях первичная структура белков не изменяется, изменяется количество белка или его распределение в тканях, или нарушается функция белка в связи с изменением условий в клетке. Например, при некоторых формах гастрита в клетках слизистой желудка прекращается образова­ние белка, обеспечивающего всасывание витамина В12. В результате развивается тяжелая форма анемии (злокачественная анемия).

Определение содержания в тканях и жидкостях организма того или иного белка нередко служит удобным, а часто, особенно в случае наследственных проте­инопатии, и наиболее точным методом диагностики заболевания. Например, на­личие HbS в эритроцитах указывает на серповидно-клеточную анемию, а не на какую-либо другую форму анемии.

Атом железа расположен в центре гема-пигмента, придающего крови характерный красный цвет. Каждая из 4 молекул гема «обернута» одной полипептидной цепью. В молекуле гемоглобина взрослого человека HbА (от англ. adult - взрослый) содержатся четыре полипептидные цепи, которые вместе составляют белковую часть молекулы - глобин. Две из них, на­зываемые альфа-цепями, имеют одинаковую первичную структуру и по 141 аминокислотному остатку. Две другие, обозначаемые бэта-цепями, также идентично построены и содержат по 146 аминокислотных остатков. Таким образом, вся молекула белковой части гемоглобина состоит из 574 амино­кислот. Во многих положениях альфа- и бэта-цепи содержат разные аминокислот­ные последовательности, хотя и имеют почти одинаковые пространствен­ные структуры. Получены доказательства, что в структуре гемоглобинов более 20 видов животных 9 аминокислот в последовательности оказались одинаковыми, консервативными (инвариантными), определяющими функ­ции гемоглобинов; некоторые из них находятся вблизи гема, в составе участка связывания с кислородом, другие - в составе неполярной внутрен­ней структуры глобулы.

В дополнение к основному гемоглобину HbA₁ в крови взрослого человека доказано существование мигрирующего с меньшей скоростью при электрофорезе гемоглобина НbА₂, также состоящего из 4 субъединиц: двух альфа-цепей и двух бэта-цепей. На долю НbА₂ приходится около 2,5% от всего гемоглобина. Известен, кроме того, фетальный гемоглобин (гемоглобин новорожденных), обозначаемый HbF и состоящий из двух а-цепей и двух Y-цепей. Фетальный гемоглобин отличается от HbA₁ не только составом аминокислот, но и физико-химическими свойствами: спектральным пока­зателем, электрофоретической подвижностью, устойчивостью к щелочной денатурации и др. Кровь новорожденного содержит до 80% HbF, но к концу 1-го года жизни он почти целиком заменяется на НbА (все же в крови взрослого человека открывается до 1,5% HbF от общего количества гемоглобина). Последовательность аминокислот в гамма - и бэта-цепях гемогло­бинов окончательно не расшифрована.