Классификация белков по гомологии их первичных структур. Семейства белков (сериновые протеазы, иммуноглобулины, семейство альбумина)

Гомологичными называются последовательности аминокислот, имеющие много сходных черт: они содержат во многих положениях одни и те же амино­кислоты. а в некоторых - различные, но близкие по физико-химическим свойст­вам. Гомологичные последовательности возникли в ходе эволюции в пределах одного биологического вида при замене отдельных аминокислотных остатков. Их конформации очень близки друг другу: количество ос-спиралей и бэта-структур, большинство изгибов и поворотов полипептидных цепей сходно или идентично. Белки, состоящие из гомологичных последовательностей аминокислот, имею­щие схожие конформации и родственные функции, объединяются в семейства белков.

Семейства белков (сериновые протеазы, иммуноглобулины, семейство альбумина).

Семейство сериновых протеаз - ферменты, имеющие в активном центре уникальный активированный остаток серина, связывают и гидролизуют пептид­ные связи в белках. Некоторые аминокислотные замены явились причиной из­менения субстратной специфичности этих протеаз. Возникло функциональное многообразие семейства:

-ферменты пищеварительного тракта - трипсин, химотрипсин и эластаза гидролизуют в денатурированных белках пептидные связи, но каждый из них -между определенными аминокислотными остатками;

-сериновые протеазы, участвующие в активации каскада белков свертыва­ния крови, образовании гормонов, активации белков системы комплемента и других, более "тонких" процессах, обладают особо высокой субстратной специ­фичностью (в процессе активации, например, сериновые протеазы гидролизуют только одну или две "особые" пептидные связи из множества, имеющегося в белке).

Объяснение состоит в том, что фермент "распознает" не только аминокис­лоты, образующие атакуемую пептидную связь, но и аминокислоты, которые ее окружают в нативной молекуле субстрата.

Иммуноглобулины, особенности строения, избирательность взаимодействия с антигеном. Многообразие антиген-связывающих участков Н- и L-цепей. Классы иммуноглобулинов, особенности строения и функционирования.

Иммуноглобулины (антитела) - это белки (Y-образные гликопротеины), вырабатываемые В-лимфоцитами в ответ на поступление в организм чужерод­ных структур (антигенов). Организм человека вырабатывает порядка 10 мил­лионов видов иммуноглобулинов, причем каждый из них производится своим клоном В-лимфоцитов. Антитела локализованы на поверхности иммунных кле­ток или находятся в свободном виде в плазме крови. Они взаимодействуют с ан­тигенами в крови, лимфе, межклеточной жидкости и секретах желез. Функция иммуноглобулинов сводится к двум этапам: 1) узнавание и связывание соответ­ствующего комплементарного антигена при помощи антигенсвязывающих уча­стков, и 2) запуск процесса, в результате которого антиген инактивируется и разрушается (активация системы комплемента).

Иммуноглобулины, особенности строения, избирательность взаимодейст­вия с антигеном. Молекулы иммуноглобулинов имеют характерную Y-образную форму, обе вершины которой связывают антиген. Каждый из них со­стоит из четырех полипептидных цепей: двух идентичных тяжелых (Н-цепей) и двух легких (L-цепей). Цепи связаны между собой четырьмя ковалентными (дисульфидными) связями. Тяжелые цепи (5 типов) специфичны для каждого клас­са иммуноглобулинов, а легкие (2 типа) присутствуют во всех классах.

Легкие цепи состоят из двух доменов: вариабельного (V_L) и константного (C_L), тяжелые цепи формируют четыре домена: один вариабельный (V_H) и три константных (С_H1 С_H2 С_H3). Все домены имеют р-складчатую структуру, стаби­лизированную дисульфидной связью между двумя остатками цистеина

Между доменами тяжелой цепи С_H1 и С_H2 аминокислотная последователь­ность содержит много остатков пролина, препятствующих формированию вто­ричной структуры и взаимодействию тяжелых цепей на этом участке. Это шар­нирный участок, придающий иммуноглобулинам внутримолекулярную подвиж­ность.

Местом специфического связывания антигена служат вариабельные участ­ки Н- и L-цепей. Специфические антитела различаются по аминокислотной по­следовательности этих антиген-связывающих участков. Взаимодействие с анти­геном осуществляется за счет нековалентных связей.

Особенность антигенспецифического участка иммуноглобулина состоит в том, что за счет слабых взаимодействий с антигеном возникает высоко ком­плементарное взаимодействие. Кдисс комплекса антиген-антитело = 10^{-15 М. Спонтанный 50% распад такого комплекса потребует 1,5 года.}

Местом специфического связывания антигена служат вариабельные участ­ки Н- и L-цепей. Специфические антитела различаются по аминокислотной по­следовательности этих антиген-связывающих участков. Взаимодействие с анти­геном осуществляется за счет нековалентных связей,

Особенность антигенспецифического участка иммуноглобулина состоит в том, что за счет слабых взаимодействий с антигеном возникает высоко ком­плементарное взаимодействие. Кдисс комплекса антиген-антитело = 10^{-15 М. Спонтанный 50% распад такого комплекса потребует 1,5 года.}

Многообразие антиген-связывающих участков Н- и L- цепей

Уникальная способность каждого клона антител распознавать и связывать соответствующий антиген определяется 20-30 аминокислотными остатками ги­первариабельных участков, расположенных на вариабельных доменах Н- и L-цепей. Расчеты показывают, что полипептид из 25 аминокислот может иметь 25²⁰ возможных комбинаций, т. е. за счет аминокислотных замен в гипервариа­бельных частях тяжелых и легких цепей в организме человека может возникать практически неограниченное число различных иммуноглобулинов.

Классы иммуноглобулинов, особенности строения и функционирования

Иммуноглобулины человека делятся на 5 классов, называемых IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, отличающихся по структуре тяжелых цепей (альфа, сигма, етта, дельта, мю).

Эти различия ответственны за характерную для каждого класса конформацию и физио­логическую функцию антитела. Связывания антитела вызывает изменения кон-формации константных доменов иммуноглобулинов, а это определяет путь уничтожения антигена. Легкие цепи имеют две разновидности - к и лямда, они при­сутствуют во всех классах иммуноглобулинов.

Иммуноглобулин М - IgM - секретируется на ранних стадиях первичного иммунного ответа. Существует в двух формах. Мономерная форма (ранняя) свя­зана с поверхностью В-лимфоцитов, служит антигенраспознающим рецептором. Более поздняя, состоящая из пяти мономеров форма имеет десять участков свя­зывания с антигеном. Секретируется в кровь при первичном иммунном ответе и наиболее эффективна против вирусов и бактерий. Повторное введение того же антигена приводит к массированной секреции IgG. Это свойство иммунной сис­темы является проявлением «иммунологической памяти».

После рождения уровни IgM рас­тут, т. к. новорожденный подвер­гается антигенному стимулирова­нию. Определение IgM у новорож­денных - оценка внутриматочной инфекции.

Иммуноглобулин G - IgG - основной класс анти­тел, секретируемых в кровь при вторичном иммунном ответе. IgG - основной противоинфекционный иммуног­лобулин, нейтрализует бактериальные токсины и, связы­ваясь с микроорганизмами, усиливают фагоцитоз. Един­ственный класс антител, проникающий через плацентар­ный барьер и обеспечивающий внутриутробную защиту плода и пассивный иммунитет новорожденных в первые недели жизни.

Иммуноглобулин А - IgA - основной класс антител в секретах (слезы, слюна, респираторные, желудочные, мочеполовые секреты, молоко), является "первой линий защиты". Микроорганизмы, покрытые специфическими IgA, не могут прикрепляться к поверхности слизистых оболочек и участвовать в заражении.

Иммуноглобулин Е - IgE - антитела, связывающие­ся после секреции с соответствующими рецепторами на поверхности тучных клеток и эозинофилов. Присоедине­ние антигена приводит к секреции клеткой активных аминов (гистамина). отвечающих за развитие воспали­тельной и аллергических реакции (при аллергической па­тологии). Роль IgE у здоровых людей - обеспечение противопаразитарного иммунитета.

Иммуноглобулин D - IgD обнаруживается на очень малом количестве В-лимфоцитов (не более 1,5%) где выполняет роль поверхностного рецептора.

Физико-химические свойства белков. Молекулярный вес, размеры и форма, растворимость, ионизация, гидратация. Методы выделения индивидуальных белков: избирательное осаждение солями и органическими растворителями.

Белки различаются по следующим физико-химическим свойствам:

- молекулярная масса, которая зависит от количества аминокислотных ос­татков в полипептидной цепи, а у олигомеров - и от числа протомеров, входя­щих в его состав; ее величина колеблется в пределах 6000 - 1000000 Д, но мо­жет быть и выше;

-форма молекулы, которая может быть глобулярной (компактной за счет того, что гидрофобные радикалы аминокислот сгруппированы в гидрофобное ядро) или фибриллярной. Форма белковой молекулы зависит от рН. В изоэлек-трической точке молекула наиболее компактна, а при изменении рН увеличива­ется;

-суммарный заряд молекулы, зависящий от соотношения ионизирован­ных анионных радикалов глутаминовой и аспарагиновой кислот и катионных радикалов лизина, аргинина и гистидина. Степень ионизации зависит от рН среды:

- при рН=7 практически все ионогенные группы белка ионизированы;

- в кислой среде увеличение концентрации Н⁺ подавляет диссоциацию кар­боксильных групп и уменьшает отрицательный заряд белка:

-СОО^- + Н⁺ ó -СООН

- в щелочной среде избыток ОН^- приводит к уменьшению положительного заряда белка:

-NH₃⁺ + ОН^- ó -NH₂ +H₂0

Величина рН среды, при котором суммарный заряд белка равен нулю, называет­ся изоэлектрической точкой. Белки, обладающие кислотными свойствами (альбумины, глобулины, пепсины) имеют в своем составе больше анионогенных (—СООН) групп, их изоэлектрическая точка лежит в слабокислой среде, а в ней­тральной среде они имеют отрицательный заряд. Белки, обладающие основными свойствами (гистоны, протамины), имеют в своем составе больше катионо-генных групп, их изоэлектрическая точка лежит в щелочной среде, в нейтраль­ной среде они имеют положительный заряд.

-растворимость в водной среде, которая определяется гидрофильностью (способностью образовывать гидратную оболочку). На растворимость так же влияет форма молекулы и состав растворителя: большинство белков лучше рас­творяются в слабом солевом растворе, чем в дистиллированной воде. Белки, имеющие любой, отличный от нуля заряд, лучше растворимы, чем белки, нахо­дящиеся в изоэлектрической точке. Легкость осаждения белков в изоэлектриче-ской точке - результат исчезновения их электростатического отталкивания, что приводит к агрегации молекул белка и выпадению их в осадок.

Белки, поверхности которых обогащены гидрофобными радикалами, лучше растворяются в липидах, чем в воде.

Методы выделения индивидуальных белков: избирательное осаждение со­лями и органическими растворителями

В дистиллированной воде белки растворяются плохо. При незначительном повышении концентрации соли некоторое количество гидратированных неорга­нических ионов связывается с поверхностью белка, уменьшая его агрегацию. При высокой концентрации соли молекулы белка лишаются гидратных оболо­чек, агрегируют и выпадают в осадок.

Выделение индивидуальных белков производят, используя различие в их растворимости при разной концентрации соли в растворе и различных значени­ях рН. После удаления соли белки могут растворяться, сохраняя нативные свой­ства. Осаждение белков из раствора (без их денатурации) можно осуществлять с помощью добавления дегидратирующих агентов - органических растворителей (этанол, ацетон).

Современные методы фракционирования белков: гель-фильтрация, элек­трофорез, ионообменная хроматография, аффинная хроматография на ос­нове специфичности связывания лиганда, специфичности катализа.

Современные методы фракционирования белков: гель-фильтрация, электрофорез, ионообменная хроматография, афинная хроматография на основе специфичности связывания лиганда, специфичности катализа.

Современные методы фракционирования белков: гель-фильтрация, элек­трофорез, ионообменная хроматография, аффинная хроматография на ос­нове специфичности связывания лиганда, специфичности катализа.

Гель-фильтрация - позволяет разделять белки по величине и форме молеку­лы. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных грану­лами пористого геля (сефадекс, агароза), проницаемого благодаря внутренним каналам (порам) с определенным средним диаметром и буферным раствором. Смесь вносят в колонку и элюируют (вымывают) буфером. Крупные белковые молекулы, не проникающие в поры геля, перемещаются с высокой скоростью вместе с растворителем. Более мелкие молекулы в той или иной степени удер­живаются гранулами геля и выходят из колонки позднее крупных. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций.

Электрофорез основан на свойстве заряженных частиц (белковых молекул) пе­ремещаться под действием электрического поля со скоростью, пропорциональ­ной их суммарному заряду. Белки, имеющие при данном значении рН и ионной силе раствора суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду, а положи­тельный - к катоду. Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакридном геле и др. На скорость миграции в крахмаль­ном и полиакриамидном гелях, кроме заряда молекулы, влияет масса и форма молекул.

Разрешающяя способность электорофореза в геле выше, чем на бумаге: при электрофорезе белков сыворотки крови на бумаге выделяются пять главных фракций, а в полиакриламидном геле - до 18 различных фракций. После завер­шения электрофореза зоны белков выявляют с помощью красителя.

Ионообменная хроматография основана на разделении белков, отличающихся суммарным зарядом. Раствор белков (при определенных значениях рН и ионной силы раствора) пропускают через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым заряженным сорбентом, при этом часть белков задерживает­ся на нем в результате электростатического взаимодействия. В качестве сорбен­та используют ионообменники: положительно заряженные анионообменники, содержащие катионные группы, - для выделения белков-анионов, несущих суммарный отрицательный заряд, или отрицательно заряженные катионообменни-ки, содержащие анионные группы, - для выделения белков-катионов, несущих суммарный положительный заряд. При пропускании белка через колонку проч­ность связывания белка с ионообменником зависит от количества групп в моле­куле, имеющих противоположный сорбенту заряд. В дальнейшем адсорбиро­ванные на ионообменном сорбенте белки элюируют буферным раствором с раз­личной концентрацией соли и рН, получая различные фракции белков. Аффинная хроматография на основе специфичности связывания лиганда, базируется на высокоизбирательном взаимодействии белков с лигандами, при­соединенными к твердому носителю. Лигандом может быть субстрат, кофермент (для выделения фермента), антиген (для выделения антител) и т. д. При пропускании через колонку смеси белков к лиганду присоединяется только спе­цифично взаимодействующий с ним белок, все остальные выходят вместе с элюатом. Адсорбированный белок элюируют раствором с измененными значе­ниями рН или ионной силы. Метод позволяет очистить выделяемый белок в ты­сячи раз при однократной хроматографии.