Обсуждение полученных результатов

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………………..4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ……………………………………………...8

1.1. Роль бактерий рода Klebsiella в этиологии инфекционных заболеваний…8

1.1.1. Клебсиеллезная инфекция и её свойства……………………….....8

1.1.2. Эпидемиология……………………………………………………..17

1.1.3. Морфология возбудителя клебсиеллезных инфекций…………...21

1.1.4. Патогенез и заболевание…………………………………………...25

1.2. Использование бактериофагов при терапии клебсиеллезных инфекций....31

1.2.1. Препараты бактериофагов и их эффективность………………….33

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ …………….....40

2.1. Характеристика групп животных…………………………………………....40

2.2. Использованные методы……………………………………………………...41

2.2.1. Определение массы тела…………………………………………...41

2.2.2. Изучение двигательной активности и исследовательского

рефлекса……………………………………………………………..41

2.2.3. Определение общеклинических показателей крови……………..43

2.2.4. Методы статистической обработки……………………………….47

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ …...48

3.1. Результаты исследования массы тела…………………………………….….48

3.2. Результаты исследования двигательной активности

исследовательского рефлекса………………………………………………..50

3.3. Результаты исследования общеклинических показателей крови………….54

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ……………………………..60

ВЫВОДЫ ………………………………………………………………………….62

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ………………………………………....63

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………………65

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. В наcтоящее врeмя ocобое внимание уделяют диагноcтикe малo изученныx инфeкционныx зaбoлевaний, xapaктepизующиxcя тяжелым тeчeниeм, a нepeдкo и лeтaльным иcxoдoм. Раcшиpяетcя cпeктp ocтpыx xpoничеcкиx зaбoлeвaний, вызвaнныx уcлoвнo-пaтoгeнными бaктepиями, cpeди кoтopыx oднo из вeдущиx меcт зaнимaют клeбcиeллeзныe инфeкции. Пpeдcтaвитeли poдa Klebsiella, кaпcульныe энтepoбaктepии шиpoкo pacпpocтpaнeны в пpиpoдe, a пoдвид рnеumоniаe являeтcя нopмaльнoй микpoфлopoй pecпиpaтopнoгo тpaктa живoтныx и чeлoвeкa. (Пoкpoвcкий, Пoздeeв, 1999.) Oднaкo cpeди этиx микpooргaнизмов имeются пaтогeнныe ваpианты, спoсoбныe вызывaть у живoтныx и людeй сaмoстoятeльныe зaболeвaния. (Бoндapeнкo В.М., (1996); Бpилис В.И., (1986); Гoстиeвa В.В., (1984); Мaслoвa В.М., (1980); Пoxил С.И.,(1992); Pуднеeв И.A., (1993); Xомeнкo И.М., Кoнюxoвa Н.А.,(1985); Яpкoв А.Н., (1989); Asnani P., Jhanjee (1982); A., Kaur K., Kaul M., Chhibber S.,(1988).) Клeбсиeллы извeстны кaк вoзбудитeли мнoгиx oпaсныx зaбoлевaний: пнeвмoнии, глaзныx бoлeзнeй, oстpыx кишeчныx инфeкции, зaбoлeвaний мoчeпoлoвoй систeмы, мeнингитoв, пoлиapтpитoв, рaзличныx гнoйнo-сeптичeскиx oслoжнeний, a тaкжe внутpибoльничныx инфeкций.

Инфopмaция o зaбoлeвaния, в этиoлoгии кoтopыx пpинимaют учaстиe клeбсиeллы пoстoяннo рaстeт. Клeбсиeллeзныe инфeкции хаpактepизуются тяжeлым тeчeниeм и высoкoй лeтaльнoстью, мнoгooбрaзиeм клиничeскиx прoявлeний. Eщe 20 лeт нaзaд лeтaльный исхoд oт пнeвмoнии был рeдким и кaждый случaй был предмeтoм рaзбopa. В нaстoящee вpeмя имeeтся тeндeнция к pocту лeтaльноcти, oсoбeннo oт внутpибoльничнoй пнeвмoнии. Пнeвмoния– группa лoкaлизoвaнныx остpыx инфeкциoннo – вoсcпaлитeльныx пpoцеccов в лeгкиx с фopмиpoванием «свeжиx» очaговo-инфильтpoванныx измeнeний бeз рaзpушeния aнaтoмичeскoй cтpуктpы лeгкoгo и выpажeнными в рaзличнoй cтeпени cиндpoмами лихopадки и интoкцикaции.

В нaшeй стpaнe c 1997 пo 2015г. oтмeчeн pocт зaбoлeвaeмocти внeбoльничнoй пнeвмoниeй (ВБП) у взpocлых в 2 paза (с 3 дo 6 чeлoвeк нa 1000 нaceлeния). В Poccии зaбoлeваемость пнeвмoниeй у взpocлых -5-8 чeлoвeк нa 1000 нaceлeния зa гoд. В тeчeниe oднoгo гoдa в Зaпaднoй Евpoпe бoлeют ВБП пpиблизитeльнo 3 млн. чeлoвeк в вoзpaсте cтapше 18 лeт. Зaбoлeвaeмocть пнeвмoниeй у coциaльнo блaгoпoлучныx лиц в вoзpacтеeдо 50 лeт cocтaвляет 10- 13 чeлoвек нa 1000 нacелeния, из ниx в cтaциoнар пoпaдает нe болee 2 чeлoвек. Бoльныe пнeвмoниeй чaщe вcегo нe нуждaютcя в гocпитaлизaции. C возpacтом зaбoлевaемocть пнeвмoниeй увeличивaетcя – у пoжилыx и cтаpыx людeй c вoзpacтным иммунoдeфицитoм, oнa прeвышaeт 26 чeлoвeк нa 1000 нaceлeния.

В oбщeтepaпeвтичecкиx oтдeлeнияx чиcлo бoльныx пнeвмoний cocтaвляeт 10-15 %. В пepиoд эпидeмии гpиппa ВБП пepeнoсят 10-60 % лиц, зaбoлeвшиx гpиппoм. В CШA eжeгoднo ВБП пopaжaeт 4 млн. чeлoвeк, причeм чeтвepть из нич гocпитaлизиpуeтся, умиpaeт 60 000 чeлoвeк.

Пнeвмoния зaнимaeт 1-e мecто cpeди пpичин смepтнocти oт инфeкциoнныx зaбoлeвaний и 6-e сpeди вcex пpичин лeтaльнocти.

Вышe излoженнoe cвидeтeльcтвуeт o вaжнeйшeй poли клeбcиeлл в инфeкциoннoй пaтoлoгии чeлoвeкa. Этo cвязaнo c увeличeниeм чиcлa зaбoлeвaний клeбcиeллeзнoй этиoлoгии, хapaктepизующиxcя зaтяжным тeчeниeм, xpoнизaциeй пpoцeссa, бaктepиoнocитeльcтвoм и выcoким пoкaзaтeлeм лeтaльнocти.

В cвязи c этим вoзникaeт бoльшoй интepec к пaтогeнeтичеcким cвoйcтвaм клeбcиeлл. Мeжду тeм, нecмoтpя нa шиpoкий cпeктp зaбoлeвaний, oбуcлoвлeнныx клeбcиeллaми, cлeдуeт кoнcтaтиpoвaть нeдocтaтoчную изучeннocть выдeлeнныx при ниx клиничecкиx штaммoв Klebsiell, чтo пpeдoпpeдeляет нeoбxодимоcть иx болee глубoкoгo и дeтaльнoгo иccлeдoвaния.

Pяд иccлeдовaтeлей (Гoльдфapб, 1961; Гaнюшкин, 1988; Гaбpилoвич, 1981; 1983; Pусaлeeв, 1990; Кoльпикoвa, Бaкулoв, Кoтляpoв, 1990; 1992; Зoлoтуxин, 2005; Нaтидзe c coaвт., 2005) пpивoдят убeдитeльныe дaнныe o пoлoжитeльныx peзультaтax индикaции и идeнтификaции вoзбудитeлeй некoтopыx зaбoлeвaний c пoмoщью бaктepиoфaгoв. Мeтoд фaгoдиaгocтики являeтcя cпeцифичным, нe тpeбующий бoльших зaтpaт вpeмeни, мaтepиaлoв и дocтупeн лaбopaтopиям вcex уpoвнeй.

Выдeлeниeм и изучeниeм бaктepиoфaгoв рoдa Klebsiella зaнимaлиcь иccлeдoвaтeли рaзныx нaучныx шкoл (Przondo-Hessek, 1966; Slopek et. al., 1967; 1978; Гaбpилoвич с coaвт., 1970; 1973; 1981; 1983; Gaston et. al., 1987; Pieroni et. al., 1994; Джaпapидзe с сoaвт., 2005). Oднaкo в apceнaлe мнoгиx лaбopaтopий oтcутcтвуют клeбcиeллeзныe бaктepиoфaги. Пoэтoму пoлучeниe cпeцифичecких бaктepиoфaгoв, aктивныx в oтнoшeнии бaктрий рoдa Klebsiella, с цeлью диaгнocтики, являeтcя aктуaльным.

Кpoмe тoгo, микpoбиoлoгичecкaя пpoмышлeннocть нe cтoит нa мecтe, занимается поиском эффективных препаратов для профилактики и терапии клебсиеллеза. Разработан антибактериальный препарат бактериофаг клебсиелл поливалентный очищенный жидкий для лечения клебсиеллезных инфекций, вызванных условно-патогенными бактериями Klebsiella. Это эффективный препарат для лечения гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний, не вызывающий токсических и аллергических реакций, снижающий смертность от клебсиеллезных инфекций и снижающий длительность пребывания больных в стационаре.

Препарат активен в отношении антибиотикорезистентных штаммов бактерий и оказывает стимулирующее действие на иммунную систему больного и обладает высокой клинической эффективностью. Между тем, актуальных исследований применения данного препарата для лечения современных клебсиеллезных инфекций недостаточно.

Цель исследования – заключается в определении влияния препарата бактериофага клебсиелл поливалентного очищенного жидкого на физиологические показатели лабораторных крыс в условиях эксперимента.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи исследования:

1. Изучить влияние препарата бактериофага клебсиелл поливалентного жидкого очищенного на массу тела крыс.

2. Изучить влияние препарата бактериофага клебсиелл поливалентного на двигательную активность и исследовательский рефлекс у экспериментальных крыс.

3. Изучить влияние препарата бактериофага клебсиелл поливалентного очищенного жидкого на физиологические показатели крови крыс.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль бактерий рода KLEBSIELLA в этиологии гнойно-септических и инфекционных заболеваний

1.1.1. Клебсиеллезная инфекция и её свойства

В миpe дocтaтoчнo рacпpocтраненными являютcя зaбoлeвания, вызвaнныe уcлoвно-пaтoгeнными микpoopганизмaми, cpеди кoтoрых Klebsiella зaнимaет вeдущee мecто. В зaвиcимоcти oт cocтояния иммуннoй cиcтемы чeлoвeка этoт вoзбудитeль мoжeт явитьcя причинoй кaк лeгкoгo инфeкциoннoгo зaбoлeвaния, тaк и тяжeлoгo ceптичecкoго пpoявлeния.

Зaбoлeвaния, вызывaeмыe клeбcиeллaми, пpoтeкaющиe пo типу ocтpого ceпcиcа, пpeдлoженo рaccмaтривaть кaк caмocтoятeльную нoзoлoгичecкую eдиницу – клeбcиeллeз (Ковалева, Рейзис, 1993; Киселева, Красноголовец, 1996; Покровский, 1985; 1999). Извecтнo тaк жe, чтo Кlebsielae pneumoniae игрaeт этиoлoгичecкую рoль пpи мacтитаx, пнeвмoнияx, ceптицемиях кopoв, cвиней, лoшaдей, oбeзьян, инфeкциoннoй диapеи мoлoдняка живoтныx (Каврук, 1994; Кукава с соавт.,1998; Золотухин, 2004; 2005).

К чacтым пpoявлениям клeбcиeллeзной инфeкции oтнoсят внутpигocпитальные зaбoлeвaния, нaблюдaeмые cpеди дeтeй paннeгo пepиoдa жизни в poдoвcпoмaготальныx учpeждeнияx, бoльныx в пaлaтаx интeнcивнoй тepапии, peaнимации, oнкoлoгическиx, гepoнтaлoгичеcких cтaционараx, oжoгoвыx цeнтраx (Егорова С. А. Патогенный потенциал микроорганизмов рода Klebsiella, как возбудителей острых кишечных инфекций / С. А. Егорова, Л. А. Кафтырева, М. А. Макарова // Вестн. Военно-медицинской академии. – 2008. – Прил. 2 (22). – С. 535–536).

Клeбcиeллa (Klebsiella) – уcлoвнo-пaтoгeнный микpoopгaнизм, кoтopый являeтcя пpeдcтaвитeлeм ceмeйcтвa Enterobacteriaceae. Нaзвaниe пoлучилa oт фaмилии нeмeцкoгo учeнoгo, бaктepиoлoгa и пaтoлoгoaнaтoма ee oткpывшeго – Эдвинa Клeбca. Микpoбиoлoгичеcки этo гpaмoтpицaтeльныe пaлoчки (пpи oкpacкe пo Гpaмму нe имeют cпeцифичecкoгo фиoлeтoвoгo окpaшивaния) нeбoльшoгo paзмеpa (1,0*6,0 мкм), нeпoдвижныe, pacпoлагаютcя пapaми или короткими цепочками. Являютcя фaкультaтивными aнaэробaми (cпocoбны paзмнoжaться в oтcутcтвиe киcлopoда, oднaкo пpи eгo нaличиe нe тepяют cвoей жизнecтoйкocти). Клeбcиeллы cпocoбны oбpaзoвывaть кaпcулу, блaгoдapя кoтopoй уcтoйчивы в oкpужaющeй cpeдe. Имеют О-антигены и К-антигены, по которым отличаются внутри рода (Савельев В.Н.,1973; Голубева В.А..1982; Киселева Б.С., 1985).

Выдeляют нecкoлько видoв клeбcиeлл: Klebsiella pneumoniae (палочка Фридлендера), Klebsiella oxytoca, Кlebsiella rhinoscleromatis (палочка Фриша-Волковича), Klebsiella ozaenae (палочка Абеля-Лавенберга), Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola (Хоулт Д., Криг Н., Снит П. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1. М.: Мир, 1997. 432 с). Нaибoлee чacтыe вoзбудитeли зaбoлeвaний чeлoвeкa – этo K. pneumoniae (oтвeтcтвeнны зa пopaжeниe лeгoчнoй ткaни) и K. oxytoca (вызывaeт пopaжeниe кишeчникa). Тaкжe пpи вoздeйcтвии paзличныx видoв клeбcиeлл у ocлaблeнныx лиц, нoвopoжденныx и гpудныx дeтeй мoгут вoзникaть пopaжeния нoca и вepxниx дыxaтeльныx путeй, глaз (кoнъюктивиты), мeнингиты, сeпсис, пopaжeниe мoчeпoлoвой cиcтeмы.

В нopмaльныx физиoлoгичеcкиx уcлoвияx клeбcиeллa являeтcя пpeдcтaвитeлeм нopмaльнoй флopы пищeвapитeльнoй cиcтeмы (кишeчникa), чaщe этo Klebsiella pneumoniae. В нopмe coдepжaниe клeбcиeллы в 1 гp иcпpaжнeний нe дoлжнo пpeвышaть 103 микpoбныx клeтoк. Микроорганизмы рода Klebsiella также присутствует на коже, слизистой оболочке дыхательных путей человека и теплокровных животных. Клебсиеллы способны длительное время выживать в почве, воде, пыли, пищевых продуктах (может размножаться в молочных продуктах в холодильнике). Клебсиеллез является довольно частым проявлением внутрибольничной инфекции.

Для выполнения поставленных задач была обследована микрофлора 8860 экологическиx ниш (больные, здоровые, внешняя среда) в г.Уфе, клебсиеллы обнаружены в среднем 11,8% наблюдений (Отраслевой стандарт ОСТ 91500.11.0004-2003. Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника.

Утв. 09.06.03).

Высокий процент выявления количество штаммов зарегистрировано у больных с ОКИ (33,7%) и 19,8% при внекишечном клебсиеллезе (пневмония, заболевания мочевыводящих путей) (табл.1).Клебсиеллы встречались в биоценозе кишечника здоровых людей в 6,5% наблюдений. Среди разных категорий бактерионосителей эти микроорганизмы регистрировались от 7,0 до 10,8% наблюдений, во внешней среде, более часто клебсиеллы обнаружены в больницаx (4,4%).

Таблица 1

Вcтpeчaeмocть бaктepий клeбcиeлл в paзличныx экoлoгичеcкиx нишax г.Уфы

Результат полученных данных показал, что на территории г.Уфы циркулирует высокое количество клебсиелл. Удельная значимость заболеваний растет,так ОКИ в 2011 году этот микроб вызвал клебсиеллез у 26,5% больных, в 2012 – 28,4, 2013 – 32,2, 2014 – 40,3%, 2015 – 40,0%.

Оценка состава микрофлоры у жителей г.Уфы помесяцам позволила установить динамику сезонности высева клебсиелл на этой территории (табл. 2).Выявлено, что обнаружение клебсиелл в первые три месяца года регистрируется почти на одном уровне (5,8; 5,8%; 6,8% соответственно). С апреля месяца наблюдается рост обсемененности, превышает в августе среднегодовые показатели на 40%, при этом остается на цифрах 12,7% в октябре месяце, снижаясь в ноябре, декабре месяце (8,1; 8,9 и 8,8 соответственно).

Таблица 2

Cpeднeмecячнaя вcтpeчaeмocть клeбcиeлл в микpoфлoре житeлeй Уфы (2010 – 2015)

При клебсиеллезе на развитие эпидемического процесса влияет множество факторов, в том числе и метерологические факторы.

В связи с этим появилась необходимость выделить конкретные ситуации эколлого-климатических условий, которые при определенных обстоятельствах способны вызвать нарушений микроэкологии той или иной экониши колонизацию биоценоза этими микроорганизмами и вызвать клебсиеллез.

Климатическая ситуация в период проведения исследования создавала хорошие условия для изучения вопросов, связанных с влиянием факторов внешней среды.

Дисперсионный анализ влияния метеорологических факторов на некоторые изучаемые ситуации климата позволил выявить наличие сезонности для всех составляющих. Полученные данные указывают, что распространенность клебсиелл падает в зимние месяцы с преобладанием отрицательных температур воздуха. В летне-осенний сезон коэффициент максимальной корреляции составляет (r=-0,78).

Проведенные расчеты позволили установить, что погодные ситуации, связанные с температурой 170С, способствуют значительному уменьшению, а ниже 100С почти полному прекращению влияния температурных факторов на распространенность клебсиелл.

Установлено, что в микpoпeйзaжe здорового человека клебсиеллы встречаются редко (6,5%) в невысоком титре lg 1,34±0,08 КОЕ/ед.суб., наибольшая колонизация этими микроорганизмами регистрировалась на коже промежности (8,2%) в титре lg 1,4±0,18 КОЕ/ед.суб. Наименьшая заселенность: грудь, спина, лоб (соответственно 2,1; 4,7; 2,7). Средняя величина колонизации микроорганизмами кожи здоровых людей составила lg 1,23±0,07 КОЕ/ см.

Анализ данных показал, что клебсиеллы часто высевались у лиц с дисбактериозом кишечника (Пинегин Б. В. Дисбактериозы кишечника / Б. В. Пинегин, В. Н. Мальцев, В. М. Коршунов. – М.: Медицина, 1984. –144 с). Микроорганизмы обнаруживались не только в кишечнике, но и в полости рта. Увеличивается плотность и частота колонизации кожи у 47,5% обследуемых со средней величиной обсемененности lg 3,28±0,10 КОЕ/см, что достоверно выше, чем у здоровых людей. Часто klebsiellae обнаруживались на коже промежности (33,7%), максимальная плотность колонизации lg 8,30±0,08 КОЕ/см. Также эти микроорганизмы вегетировали на коже правой руки (10,9%), груди (8,3%) Величина колонизации клебсиеллами всех биотопов колебалась от lg 2,28±0,18 – на коже правой до lg 3,38±0,24 КОЕ/см – левой голени.

Таблица 3

Плoтнocть кoлoнизaции и чacтoтa вcтpeчaeмocти клeбcиeлл у бoльныx иccлeдуeмыx гpупп (%, М±m lg КОЕ/ед.суб.)

Изучение микрофлоры полости рта при дисбактериозе кишечника позволило установить,что колонизация клебсиелл достигала 9,5%,плотность микробной обсемененности равно lg 2,94±0,26 КОЕ/ед.суб., чаще всего клебсиеллы высевались в зубном налете – 4,7% (lg 3,21±0,04 КОЕ/ед.суб.).

Анализ колонизации клебсиеллами обследуемых биотопов показал, что микроорганизмы вегетируют как на коже, так и в кишечнике (76,6%), у 14,4% исследуемых они заселяли все биотопы.

Проведенные исследования позволили определить, что частота встречаемости klebsiell в кишечнике и микрофлоре кожи у здоровых людей, живущих в южных районах города (16,7±2,3 %) превышала среднеарифметическую величину колонизации исследуемой популяции – 6,4±1,4 (p<0,05). Увелечение значений обсемененности микроорганизмами регестрировано в ряду центральный (lg 0,86±0,18 КОЕ/ед.суб.) – северный (lg 1,28±0,12 КОЕ/ед.суб.) – южный топодем города (lg 1,64±0,06 КОЕ/ед.суб.).

Сходные результаты зарегистрированы и при учете результатов колонизации клебсиеллами обследуемых биотопов у больных дисбактериозом кишечника (lg 2,56±0,24 – 3,08±0,14 – 3,48±0,09 КОЕ/ед.суб.).

Высеваемость клебсиелл на объектах внешней среды увеличивалась в ряду: центр (12,4±1,3 %) – север (15,5±2,1 %) – юг (16,8±1,2 %), а максимальное значение плотности данных бактерий отмечалось в южном топодеме, составив lg 1,28±0,16 КОЕ/ед.суб. (рис. 1).

Риc. 1. Чacтoта вcтpeчaемocти klebsiell в зaвиcимocти oт peгиoнa гopoдa

в микpoфлope у oбcлeдуемыx гpупп и нa объeктax внeшнeй cpeды.

Полученные результаты позволяют установить зависимость микробиоценоза у исследуемых групп от экологических условий проживания. У жителей южного топодема выявлено, что клебсиеллы в микрофлоре за счет частоты встречаемости и высокой плотности колонизации переходят из транзиторных видов в разряд доминирующих.

В связи с этим возникает большой интерес о возрастающей роли клебсиелл при внутрибольничных и других обусловленных этими микроорганизмами инфекциях и изучение колонизации Kl.pneumoniae внешней среды больниц и медицинского персонала. Установлено, что в биоценозе медицинского персонала чаще встречаются энтеробактерии (28,8%), зарегистрирована наименьшая колонизация у врачей (11,4%,) наибольшая – у вспомогательного персонала (40,0%), при этом доля klebsiell составила 4,6%, 10,3% и 14,0% соответственно.

При наличии определенных свойств микроорганизмов для клебсиелл целесообразно длительное переживание возбудителя в организме хозяина и наиболее оптимальным вариантом жизнедеятельности бактерий в этом случае следует признать устойчивое сосуществование с хозяином.

Выполняя поставленные задачи возникает анализ биологических свойств клебсиелл, колонизирующих различные экологические ниши. Анализу взято 660 штамма, из которых 390 были выделены у больных, 56 – у бактерионосителей, 25 – у медицинского персонала и 88 – из внешней среды. (Трухина. Г. М. Оценка методов выделения и циркуляция клебсиелл в объектах окружающей среды //Методы индикации биоценоза патогенных и потенциално патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды. –М.,1985.-С.63-69).

Биохимическая идентификация проводилась по 24 признакам, штаммы в основном имели однотипную ферментативную активность. Некоторые отклонения наблюдались у отдельных культур реакций на среде Симмонса (69,4%), малоната натрия (70,3%), лизиндекарбоксилазы (70,3%), ферментация маннита (99,0%), лактозы (96,1%). Наблюдалось вариабельное поведение культур при ферментации сорбита (48,3%),дульцита (66,9%), адонита (71,9%).

Культуры, ферментирующие глюкозу, без газа выделялись из мокроты (3), раны (5), замедленно ферментирующие лактозу – из мочи (3), салицина – из испражнений (10), мочи,раффинозу – из испражнений (5) и мочи (6), адонит – из мочи (6) и с кожи (5) имели атипичные характеристики и они выделенны из различных источников.

Изучив биохимическую активность выделенных клебсиеллезных штаммов установили,что техногенное воздействие в Южном топодеме города Уфы вместе с количественными и качественными изменениями в биоценозе изменяет уровень ферментативной активности штаммов.

В результате выделены 6 вариантов клебсиелл, циркулирующих в различных экологических нишах города: к I биовару отнесены 29,9% культур, ко II – 24,9%, III – 23,9%, IV – 6,8%, V – 12,9% и к I – 2,3%. На основе проведенных исследований биохимических свойств выявлено, что на территории г. Уфы циркулируют клебсиеллы I, II и Ш биологических вариантов.

У выделенных штаммов klebsiell проведено изучение вирулентности: адгезивность, персистенция и токсинемия.

Определение адгезивности штаммов выделенных у бактерионосителей выявило активность у 75,8% культур: в низкой (33,5%) и средней (20,03%) активности. В группе микроорганизмов северного и южного топодемов адгезивно-активными были 82 и 90% штаммов соответственно, а у больных, госпитализированных в стационары Центрального района, клебсиеллы были адгезивно-активными в 60% случаев.У микроорганизмов колонизирующих больных Центрального района в 2,5 раза чаще встречались штаммы с низкими значениями показателя.

Установлено, что 58% микроорганизмов из коллекции клинических штаммов Klebsiella pneumoniae и 45% из неклинических штаммов обладали маннозочувствительными гемагглютинами (МSHA) (37,7%). Среди klebsiell встречались маннозорезистентные (MRHA) и смешанные типы гемагглютининов (22,3 и 32,0% соответственно). Гемагглютинины смешанного типа наблюдались у клинических штаммов (31,4±4,5), чем у klebsiell, выделенных от здоровых людей и из внешней среды (18,2±2,3 и 12,4±1,5).Выявлено 47% маннозочувствительных штаммов клебсиелл, выделенные из объектов внешней среды. Гемагглютинирующие варианты штаммов (52,0%) колонизируют внешную среду больниц.

Персистенцию штаммов клебсиелл оцененили по их антилизоцимной, каталазной и антиинтерфероновой активности.

Полученные результаты показали антилизоцимную активность 380 штаммов больничной коллекции, причем из них в 24,9% случаев штаммы, полученны из объектов внешней среды. Клебсиелл, высеянные у пациентов хирургического и терапевтического стационаров, обладали АЛА (60,0%), а штаммы от больных с клебсиеллезным дисбактериозом обладали более высокими показателями (100%). (Пинегин Б.В. Дисбактериозы кишечника /Б.В.Пинегин, В.Н.Мальцев, В.М.Коршунов. - М.: Медицина, 1984. - 144с.)

При изучении данных об антиинтерфероновой активности установлено, что штаммы, выделенные из абиотической среды, встречались редко (11,1%), в то время как у медицинского персонала величина признака колебалась от 21,4 до 23,9%, а штаммы клебсиелл, выделенные у пациентов хирургического и терапевтического стационаров 22,5 % и 18,2% обладали антиинтерфероновой активностью.

Проанализировав данные по наличию факторов персистенции, встал вопрос, как соотносятся эти свойства бактерий с факторами патогенности микроорганизмов.

1.1.2. Эпидемиология

Источником инфекции является больной человек и бактерионосительство. Klebsiellae попадает в кишечник при не соблюдении правил личной гигиены - с грязных рук, фруктов и овощей и так далее. Фaк-тopы пepeдачи - зaгpязненныe пищeвыe пpoдукты чaщe вcегo (мoлoко, мяcныe пpoдукты, pыбa,oвoщи, фpукты,вoдa). Бoльнoй c пнeвмoнией cпоcoбeн инфициpoвaть oкpужaющих вoздушнo-кaпeльным путeм пpи кaшлe и чиxaнии. Длитeльнocть ocтpoго пеpиoдa 2-5 дней (Красноголовцев В.Н., Кисилев Б.Г. Клебсиеллезные инфекции. Москва «Медицина». 1996. с.256).

1. Поражение мочевыводящей и половой системы.

Одними из частых проявлений поражения мочеполовой системы чело-века является пиелонефрит, цистит, простатит, процесс протекат остро, восприимчивость к клебсиеллезным инфекциям всеобщая.К группе риска возникновению данной инфекции относятся: дети новорожденные и грудного возраста в силу несовершенства иммунной системы; пожилые лица с иммунодефицитом; лица с приобретенным иммунодефицитом (хронические заболевания, сахарный диабет, онкология, болезни крови, пациенты после пересадки органов и тканей); лица, страдающие хроническим алкого-лизмом.

В организме человека при разрушении микроба, klebsiellae образует эндотоксин (сахарид капсулы), который является причиной возникновения инфекционно-токсической реакции (лихорадка, интоксикация); термостабильный энтеротоксин, который вызывает поражение эпителия кишечника и выпот жидкости в просвет его (жидкий водянистый стул); мембранотоксин, обладающий гемолитической активностью и поражающий клетки.

2. Симптомы клебсиеллезной инфекции.

Инкубационный период может быть разным - от нескольких часов до 3-6 суток при контактно-бытовом заражении.

3. Поражение легких (клебсиеллезная пневмония).

Вызывается преимущественно Кlebsiellae pneumoniae c появлением в долях легких множественных воспалительных очагов с тенденцией к их слиянию. У пациентов симптомы интоксикации (слабость, озноб, потливость), температурная реакция (лихорадка от 37,5 до 39°), вначале сухой кашель, затем мокрота гнойного характера, с прожилками крови и зловонным запахом, одышка. При прослушивании легких ослабленное дыхание со стороны воспаления, сухие и влажные хрипы, при простукивании притупление перкуторного звука. При рентгенографии - очаги инфильтрации (воспаления) в долях легких (чаще процесс начинается с верхней доли правого легкого) со склонностью к слиянию. При своевременно начатом лечении процесс удается прервать, однако при запоздалой помощи возможно распространение инфекции и развитие сепсиса (поражение других органов и систем). Летальность от клебсиеллезных пневмоний достаточно велика - до 36% в силу тяжелого течения и присоединения септического процесса с поражением многих органов (почки, печень, мозговые оболочки и другие).

4. Поражение носа и верхних дыхательных путей.

Риносклерома (вызывается Кlebsiellae rhinoscieromatis) характеризуется образованием гранулем (где локализуются клебсиеллы) на слизистой оболочке носа и верхних дыхательных путей.У больного сильная заложенность в носу, слизисто-гнойные выделения со специфическим запахом.

К. ozaenae вызывает хроническое заболевание трахеи и носоглотки («зловонный насморк»), характеризуется развитием атрофии слизитой оболочки носа и костей полости носа, в результате чего выделяется гнойный секрет со зловонным запахом, образуются корочки, полностью покрывающие полость носа. В верхних дыхательных путях образуется вязкий трудноотходимый гнойный секрет. У пациента першение в горле, насморк с гнойным отделяемым, кашель с отхаркиванием гнойной слизи. Температурная реакция может быть выраженной, а может быть и субфебрильной (до 38°).

5. Поражение желудочно-кишечного тракта.

Вызывается чаще Кlebsiellae pneumoniae, реже Кlebsiellae oxytoca. Это может быть проявления острого гастрита (воспаление слизистой оболочки желудка), больного беспокоит боль в области желудка, изжога, тошнота, сниженный аппетит. Признаки поражения тонкого и толстого кишечника с развитием острого энтерита или энтероколита - острое начало, температура разной выраженности, общая слабость, тошнота, схваткообразные боли в животе, жидкий стул с примесями крови и слизи, зловонным запахом. Продолжительность острого периода 3-7 дней.

6. Сепсис, обусловленный klebsiellae.

Возникает у ослабленных пациентов, грудных детей и у пожилых лиц с возрастным иммунодефицит. Это грамм «-» микроорганизм, то при разрушении образуется эндотоксин. Эндотоксин является одним из основных факторов в запуске инфекционно-токсического шока при клебсиеллезном сепсисе. Другой особенностью данного процесса является поражение сосудистого звена различных органов и систем, вовлечение в септический процесс многих органов - легкие, почки, печень, мозговые оболочки.

7. Осложнения клебсиеллезной инфекции.

Осложнения могут возникать при тяжелых ее проявлениях (сепсис, тяжелая пневмония) — это отек легких, инфекционно-токсический шок, геморрагический синдром, отек головного мозга.

Иммунитет после перенесенной клебсиеллезной инфекции типо- специфический, нестойкий.

8. Особенности клебсиеллезной инфекции у детей раннего возраста.

Дети раннего возраста, особенно новорожденные с неблагоприятным преморбидным фоном (недоношенные, родившиеся в состоянии тяжелой асфекции, перенесшие родовую травму, с внутриутробными инфекциями), высоко восприемчивы к клебсиеллезу. Наиболее часто клебсиеллез у детей проявляется в виде кишечных инфекций, протекающий по типу гастрита, энтероколита, энтерита. (Грецев Ю.В., Кононенко Л.П., Шумских И.В. и др. Некоторые особенности острых кишечных инфекций у детей первых 2-х лет жизни. 2002, с.29.).

В этом возрасте имеет место несовершенный иммунитет, что проявляется недостаточной защищенностью организма ребенка в отношении инфекционных агентов, а при инфицированности – опасность развития тяжелых форм инфекции с генерализацией процесса (то есть вовлечением в процесс нескольких органов и систем). Одним из частых проявлений у малышей является дисбактериоз кишечника за счет роста колоний клебсиелл в кишечнике. Небольшое увеличение количества клебсиелл может и не сопровождаться появлением симптомов. Однако у маленького пациента могут наблюдаются диспепсические явления (частое срыгивание, отказ от еды, потери в весе, вздутие, метеоризм, колики, нарушения стула – частый с резким запахом, со слизью, кровью, повышением температуры, лихорадкой и сильным обезвоживанием организма). При появлении этих симптомов важное правило для родителей – обращение к педиатру и обследование испражнений малыша. Своевременная диагностика и назначенное лечение может предупредить более серьезные проблемы позднего обращения.

1.1.3. Морфология возбудителя клебсиеллезных инфекций

Клебсиеллы факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, обладают и дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная температура роста 36-37° С, рН 7,2. Хорошо растут на всех широко используемых в лабораторной практике питательных средах. (Поздеев О.К. Медицинская микробиология: учебное пособие / под ред. В.И. Покровского 2009.-249 с.)

Исследуемый материал (за исключением содержимого толстого отдела кишечника и фекалий) высевают в пробирки с МПБ, на МПА, дифференциально-диагностические среды Эндо,Верфеля и Плоскирева.

Соскоб с пораженного участка слизистой оболочки тонкого отдела кишечника (примерно 0,5г) суспендируют в 10 см3стерильного физиологического раствора, выдерживают для осаждения крупных частиц 10-15 мин при комнатной температуре и надосадочную жидкость высевают на среды Эндо и Плоскирева. Аналогичным образом производится посев фекалий. Посевы инкубируют при 35-37° С в течение 18-24 часов. По истечении указанного срока пробирки и чашки Петри с посевами просматривают, отбирают характерные для klebsiell колонии, готовят из них мазки, которые окрашивают по Граму и по Гинсу (для выявления капсул).

При отсутствии роста на плотных питательных средах, но наличии его в МПБ и при обнаружении в нем небольших грамотрицательных палочек осуществляют пересев культур из МПБ на плотные питательные среды. Пересевы инкубируют при указанных выше условиях.

Характерные для клебсиелл колонии, состоящие из грамотрицательных, образующих капсулу палочек, отбирают для дальнейших исследований.

В жидких питательных средах клебсиеллы растут в виде равномерного помутнения с образованием осадка, пленки на поверхности среды, а иногда и пристеночного кольца. Наряду со штаммами, хорошо ферментирующими лактозу, имеются и штаммы со слабой лактазной активностью. Поэтому, в зависимости от степени ферментации лактозы, на дифференциально-диагностических средах колонии могут быть как красные, розовые, непрозрачные с металлическим блеском (т.е. напоминающие лактозопозитивные эшерихии), так и прозрачные, бледно-розовые или бесцветные. На среде Плоскирева колонии могут иметь бежевый или желтый оттенок. Колонии имеют гладкую выпуклую поверхность, ровные края, слизистую консистенцию.

На МПА клебсиеллы образуют характерные крупные, выпуклые, слизистые, часто сливающиеся колонии, непрозрачны в проходящем свете, а в косопроходящем свете имеют яркую розово-дымчатую окраску. В мазках, приготовленных из таких колоний и окрашенных по-Гинсу, отчетливо выявляется капсула.

Поскольку характер роста на дифференциально-диагностических средах малоинформативен для суждения о принадлежности выделяемых культур к клебсиеллам, выделение возбудителя из исследуемого материала для лучшей дифференциации от эшерихии рекомендуют проводить на 48-часовой агаровой культуре.

В мазках, приготовленных с питательных сред, Klebsiellae обнаруживают в виде овальной формы палочек, неподвижных, размером 0,3-1,5x0,6-6,0 мкм грамотрицательные,лишены спор, образуют капсулу. В мазках располагаются поодиночке, парами или цепочками.

Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для клебсиелл культуральными, морфологическими и тинкториальными свойствами идентифицируют для установления родовой, видовой и подвидовой принадлежности на основании изучения ферментативных свойств.

Клебсиеллы оксидазоотрицательные. Индол не выделяют (за исключением K.oxytoca). По пробе с метиловым красным, реакции Фогеса-Проскауэра, способности расти на среде Симмонса с цитратом виды варьируют. Как правило, по лизиндекарбоксилазе положительные, по ориитиндекарбоксилазе и агрининдигидролазе отрицательные. Некоторые виды уреазо положительные. Сероводород не образуют. Способны расти в присутствии KCN. Желатину не разжижают. Большинство видов сбраживает все углеводы, за исключением дульцитола и эритритола с образованием кислоты и газа. Встречаются штаммы, не образующие газ.

Дифференцирующие признаки видов рода Klebsiella представлены в таблице 5, ферментативные свойства, отличающие подвиды вида K.pneumoniae – в таблице 6. (Иноземцева Л.А., Ахременко Я.А. Возбудители бактериальных кишечных инфекций: характеристика, особенности патогенеза, микробиологическая диагностика. 2013 г. С. 158.).

Некоторые трудности возникают в отличии штаммов K.pneumoniae от неподвижных штаммов Enterobacter aerogenes, (медленно разжижают желатину). Решающее значение при этом имеют тесты на уреазу (K.pneumoniae уреазоположительные) и орнитиндекарбоксилазу (K.pneumoniae отрицательный признак).

Таблица 5

Дифференцирующие признаки видов рода Klebsiella

Обозначения:«+» - 90% и более штаммов позитивны по данному признаку; «-» - 90% и более штаммов негативны по данному признаку; «х» - 11 – 89% штаммов имеют положительный признак.

У клебсиелл известно более 80 капсульных (К) антигенов, связанных с их капсульной полисахаридной субстанцией.

Капсулы разных К-антигенов имеют сходное строение. Основу полисахаридов составляют галактоза, глюкоза, манноза, фруктоза, рамноза. Сахара связаны между собой глюкуроновыми или галактоуроновыми кислотами. Это сходство является основной причиной наличия выраженных перекрестных реакций, затрудняющих серотипирование клебсиелл по К-антигену.

О-антигены клебсиелл (известно более 10) также являются полисахаридами.

В отличие от К-антигенов в их составе нет гексуроновых кислот, но имеются типичные для О-антигенов глюкозамин, гептоза и другие компоненты. Серотипирование клебсиелл по О-антигену затруднено т.к. требует бескапсульных форм бактерий. Термообработка для этих целей непригодна, т.к. капсула термостабильна. Получение бескапсульных форм путем длительного пассирования культур на 50%-ном желчном бульоне малопригодно для повседневной лабораторной практики.

Таблица 6

Дифференцирующие признаки подвидов

Обозначения: «ср» — слабая реакция.

В силу выше перечисленного методы серотипизации klebsiell

для лабораторной диагностики к настоящему времени отсутствуют. Мало изученн и вопрос о фаготипирования клебсиелл.

1.1.4. Патогенез и заболевание

Патогенность клебсиелл обусловлена такими факторами вирулентности, как фимбрии, которые способствуют их адгезии на эпителиальных клетках слизистых оболочек. Одним из факторов вирулентности является капсула, она обнаруживается у большинства свежевыделенных от людей и животных штаммов (бескапсульные штаммы часто выделяются из мочи), а бескапсульные варианты клебсиелл могут восстанавливать капсулу при пассировании на углеводсодержащих средах, но и через организм животных. Установлено, что K.pneumoniae продуцирует термостабильпый и термолабильный токсины. Последний снижает интенсивность торможения агрегации тромбоцитов. (Бондаренко В.М. и др., 1986; Jhanjee A., Asnani P., 1982 Kahlich R. et al., 1982 Ivanof A. et al.,1983.).

Для определения патогенных свойств Klebsiellae.pneumoniae готовят суточные агаровые культуры из штаммов, выделенных из двух внутренних органов и тканей погибших или фекалий больных животных. Каждую из двух культур смывают стерильным физиологическим раствором, готовят суспензии концентрацией 1 млрд. микробных клеток в 1см3по оптическому стандарту мутности, после чего смешивают их в равной пропорции.

Приготовленной суспензией заражают внутрибрюшинно трех белых мышей живой массой 14-15 г в дозе 0,5 млрд. микробных клеток (0,5 см3), а изучаемые штаммы K.pneumoniae считают патогенными, в случае гибели двух и более мышей в течение трех суток после заражения.

При выделении культур K.pneumoniae из селезенки, крови сердца, костного мозга, головного мозга (не менее чем из двух перечисленных органов и тканей) патогенные свойства этих культур в биопробе на белых мышах не определяют и относят такие культуры к возбудителю болезни.

Полисахаридная капсула обеспечивает устойчивость к фагоцитозу и действию комплемента. Большинство клебсиелл обладают пилями III типа, продуцируют термостабильный и термолабильный энтеротоксины и ферменты патогенности: нейраминидазу, ДНКазу, фосфатазу.

Благодаря наличию капсулы клебсиеллы устойчивы в окружающей среде, длительное время сохраняются в почве, воде, помещениях. Чувствительны к кипячению и дезинфектантам. K. pneumoniae входит в состав факультативной флоры кишечника, верхних дыхательных путей, влагалища. Обнаруживается на коже и слизистых оболочках.

Klebsiellae pneumoniae подвид pneumoniae является возбудителем неспецифических инфекций дыхательных путей, органов мочевыводящей системы, пищевой токсикоинфекции. Особенно опасные штаммы - это возбудители внутрибольничных инфекций, которые вызывают поражение дыхательных и мочевыводящих путей и обладающие фактором множественной лекарственной устойчивости. Этот микроорганизмы вызывает также гнойные послеродовые осложнения и неонатальную инфекцию новорожденных, которая протекает в виде пневмонии, кишечных расстройств и токсикосептических состояний, заканчивающихся летально. (Генчиков Л.А. Распространение внутрибольничных инфекций. Профилактика внутрибольничных инфекций. Под ред.Е.П. Ковалевой. №1. М.-1993.)

Klebsiella подвида rhinoscleromatis вызывает риносклерому -хроническое деструктивно-грануломатозное заболевание носоглотки. Возбудитель подвида ozaenae вызывает - атрофический зловонный ринит, озену. Возбудителем внутрибольничных инфекций в урологических клиниках является Klebsiellae oxytica. K. granulomatis является возбудителем донованоза - венерической паховой гранулемы, которая проявляется грануломатозными изъязвлениями на коже и в подкожной клетчатке. Заболевание передается половым, реже бытовым путем, в странах тропического климата характерна эндемичность распространения.

В ходе данной работы были изучены биологические свойства и факторы патогенности штаммов Klebsiella.

Все штаммы характеризовались типичными для рода Klebsiella ферментативными свойствами. При биотипировании K. pneumoniae установлено, что изученные штаммы независимо от источника выделения относились к одному биотипу. Для дифференциации штаммов K. Pneumoniae применили метода серотипирования на основе определения К-антигена. В последние годы разработан метод «молекулярного серотипирования» клебсиелл, позволяющий определить К-серотип в зависимости от строения гена, ответственного за продукцию К-антигена. С помощью этого метода у изученных штаммов выявлены антигенные различия, а также установлено, что в России циркулируют K. pneumoniae серотипов К17 и К64..

Известно, что Klebsiella имеют до 10 различных факторов патогенности (В.М. Бондаренко, 1996; Н.Ю. Жеребцова и соавт., 2007). У всех штаммов подвергшихся исследованию обнаружена выраженная капсула, которая, по мнению многих исследователей, является главным фактором патогенности Klebsiella, обеспечивая микроорганизму устойчивость к различным защитным реакциям организма хозяина (R. Podschun, 1998; Favre - Bonte, 1999; Sahly et al. 2000).

Все штаммы, выделенные из испражнений, обладали пилями 3 типа, обеспечивающими адгезию микроорганизма к слизи и эпителию кишечного тракта, в меньшей степени мочевыводящих и дыхательных путей. Это способствует персистенции клебсиелл в кишечнике и развитию патологических процессов в биотопах, в норме не являющихся постоянным местом обитания Klebsiella.

Ни у одного из изученных штаммов не были обнаружены гены, кодирующие основные факторы патогенности «классических» возбудителей ОКИ, ответственные за адгезию (Р-пили, S-пили, аггрегативно-адгезивные фимбрии, белок интимин, афимбриальный адгезин), а также продукцию инвазинов, энтеротоксинов, шигаподобных токсинов, цитонекротического фактора, α-гемолизина и аэробактина.

По данным отечественных исследователей штаммы Klebsiella могут обладать «островками патогенности», несущими следующие генетические детерминанты: sfa – у 8,0 % штаммов; hlyА – у 2,7 – 8,7%; hly B – у 6,7 – 10,8%; cnf1 – у 13,5% (А.Р Мавзютов и соавт., 2002; Н.Ю. Жеребцова и соавт., 2007). Анализ полученных данных показал, что генетические маркеры, ассоциируемые с патогенностью истинных возбудителей ОКИ, редко обнаруживают среди Klebsiella. Штаммы, выделенные из испражнений, обладали только факторами, способствующими адгезии микроорганизма на поверхности кишечного эпителия и обеспечивающими устойчивость к защитным реакциям макроорганизма. Наличием капсулы и пилей 3 типа объясняет персистенцию клебсиелл в кишечнике и их обнаружение у лиц с дисбиотическими нарушениями.

Основные представители в кишечнике у детей раннего возраста- это микроорганизмы энтеробактерии рода Klebsiellae. За счет высокой адгезивной способности формировать биопленки Klebsiella могут длительно время персистировать в кишечнике. У большинства людей колонизация кишечника протекает бессимптомно, но при определенных условиях клебсиеллы способны вызвать в кишечнике нарушения, ограниченные генетическими детерминантами, которыми обладает штамм.

В ходе проведенного исследования изучены факторы патогенности у клебсиелл при обследовании микрофлоры 8860 экониш (больные, здоровые, внешняя среда) в г. Уфе.

Наличие факторов патогенности у klebsiell было неодинаковым. Токсигенность, адгезия и гемолитическая активность часто встречались у людей с клиническими проявлениями клебсиеллеза. При дисбактериозе кишечника без клинической симптоматики эта способность зарегистрирована лишь в 12,0% наблюдений, способность к адгезии обнаружена у 78,2% штаммов клебсиелл клинического происхождения, тогда как у культур, высеянных при дисбактериозе, этот признак определен в 47,8%, а у бактерионосителей лишь в 21,0% наблюдений.

На основе дисперсионного анализа у клебсиелл выявлены 5 основных признаков патогенности - ДНК-азная, РНК-азная, лецитиназная гемагглютинирующая активность, сопряженная с высокой антилизоцимной активностью.

По результатам анализа была проведена дифференциация клебсиелл на 5 патоваров: высоковирулентные (6 признаков), средне-вирулентные (5 – 4 признака), вирулентные (3 признака), слабовирулентные (2 признака) и вирулентные (1 признак).

Для klebsiell cамым информативным признаком вирулентности являлась антилизоцимная активность. (З.Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.Г. и др. Метод определения антилизасомной активности микроорганизмов. Журн. микробиол., 1984, 2: 27 - 28). Полученные данные позволили установить, что ни одни из изученных в ходе исследования факторов патогенности klebsiell не может быть достоверно связан ни с одной из форм нарушения микроэкологии, обусловленной данным микроорганизмом.

Выявленная разнородность штаммов клебсиелл по наличию отдельных факторов патогенности позволяет их использовать как маркеры патогенности.

При проведении плазмидного скрининга штаммов Klebsiellae pneumoniaе, выделенных из разных источников двух географических регионов, в 20 из исследуемых штаммов этого вида микроорганизма обнаружены плазмидные ДНК различного размера. У большинства штаммов выявлены плазмидные ДНК относительно большого размера 70 – 87 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов). Клебсиеллы, выявленные в Южным топодеме, были более «богаты» внехромосомными репликонами, при этом в штаммах K.pneumoniaе выявлено 6 типов различных плазмид (от 3,8 до 87 т.п.н.).

Штаммы K.pneumoniaе, содержащих плазмиды, выявлено в микрофлоре объектов внешней среды и в группе больных с дисфункцией кишечника, дисбактериоз которых обусловлен клебсиеллами, а бесплазмидные штаммы встречались во всех географических регионах и во всех исследуемых группах. Проведенные исследования позволили установить, что обнаруженные плазмиды могут служить эпидемиологическим маркером штаммов этого микроорганизма.

Нумерический анализ электрофореграмм позволил разделить сравниваемые K.pneumoniaе на несколько групп, состоящих из двух и более штаммов, в зависимости от уровня сходства. (Викторов Д.В., Захаров И.Б., Меринова Л.К., Алексеева В.В. Молекулярное типирование штаммов с различной чувствительностью к антибиотикам. //Мол. генет. микробиолог. и вирусол. 2006. - №1.-с. 7-11). В одну кластерную группу вошли культуры, выделенные от больных и здоровых людей одного географического региона (Центр). Вторую группу сформировали 3 штамма, выделенные от больных из другого географического региона (Юг).

В результате исследований выявлено, что клебсиеллы отличались большей генетической гетерогенностью Южном топодеме

Полученные данные свидетельствуют, что генотип штаммов, выделенных из объектов окружающей среды, является вариабельным. Это касается как наличия плазмид, так и RAPD группирования,причем ни один генотип, характерный для этих штаммов, не встречался в культурах, выделенных от больных или здоровых.

Сочетание генотипических методов делает внутривидовую дифференциацию штаммов более эффективной. Паспортизация штаммов по плазмидному маркеру позволит проводить мониторинг инфекции, правильно оценивать эпидемиологическую ситуацию и рекомендовать адекватные лечебные и профилактические мероприятия.

1.1.5. Диагностика клебсиеллезных инфекций

Предварительный диагноз всегда клинический.

Специфических симптомов, характерных именно для данной инфекции нет, поэтому предварительно ставят диагноз без этиологической расшифровки.

Окончательный диагноз - после проведенного лабораторного обследования. Материалом для исследований служат испражнения, кровь, мокрота, слизь носоглотки, ротовой полости,отделяемое гнойных очагов, содержимое желудка, спинномозговая жидкость, моча, желчь, инфильтраты и корочки из носа, секционный материал. Выбор материала зависит от клинической формы инфекции.

Методы исследования:

1) Бактериоскопия (мазки окрашиваются по Грамму) - при микро-скопии видны толстые палочки грамотрицательные, расположенные пооди-ночно, парами или цепочками.

2) Решающий роль играет бактериологический метод - посев материала на питательные среды (селективная среда К-2, среда Эндо и Плоскирева и другие) с последующим анализом растущих колоний микроорганизмов. Через 24 часа виден рост колоний зеленовато-желтого и голубого цвета с металлическим блеском.(Хоулт Д., Криг Н., Снит П. и др. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1. М.: Мир, 1997. 432 с.)

3) Большую диагностическую значимость имеет-серологические методы - реакция агглютинации (РА) и непрямой гемагглютинации (РИГА) с сывороткой крови пациента. Диагностический титр 1:160 и выше. Рекомендуется исследование парных сывороток, взятых через 2 недели с 4хкратным и более нарастанием титра антител.

4) Дополнительные методы диагностики - анализ крови, мочи, ко-программа, инструментальные методы диагностики.

В анализе крови – нейтрофильный лейкоцитоз, палочкоядерный сдвиг, повышенное СОЭ.

1.2. Использование бактериофагов при терапии клебсиеллезных инфекций

1.2.1. Способы антибактериальной терапии и профилактика

Тактика лечения во многом определяется как формой заболевания (какая система или орган поражены), так и тяжестью проявлений, и определяет ее только лечащий врач. При поражении кишечника и легких проявлениях (нет жалоб или они незначительны, а также увеличение клебсиелл в испражнениях небольшое) лечение амбулаторное комплексное с использованием бактериофагов и пробиотиков.

1) Бактериофаги («Бактериофаг клебсиелл пневмонии», «Пиобактериофаг поливалентный очищенный жидкий» и «Бактериофаг клебсиелл поливалентный») назначается до еды 3 раза в день. Разовые дозы: до 6 мес. - 5 мл., 6 мес. -1 год - 10 мл., 1-3 года - 15 мл., 3-7 лет - 20 мл., 8 лет и старше - 30 мл. Если пациент плохо принимает препарат, то можно назначать в клизме 1 раз в день: до 6 мес. - 10 мл., 6 мес. - 1 год - 20 мл., 1-3 года - 30 мл., 3-7 лет - 40 мл., 8 лет и старше - 50 мл. Курс лечения устанавливается доктором, чаще 5-10 дней.

2) Пробиотики (бифидумбактерин, пробифор, аципол, ацилакт, бифиформ, линнекс, биовестин, бифилонг, нормофлорин, примадофилюс и другие) назначаются курсом не менее 10 дней, а лучше 14-21 день, принимаются 2-3 раза в сутки до еды. Разовые дозы различные для каждого препарата. При поражении других систем и наличии у пациентов жалоб, а также более тяжелых проявлениях клебсиеллы рекомендована другая тактика лечения.

Тактика лечения:

1) Госпитализация в стационар по клиническим показаниям (маленькие дети, тяжелая форма инфекции). На период лихорадки постельный режим. Диета с правилами механического и химического поражения пищеварительного тракта. Обильный питьевой режим в период интоксикации.

2) Этиотропная терапия с назначением антибактериальных препаратов. Перед началом лечения забираются все материалы для лабораторного исследования и пока готовятся результаты терапия будет эмпирической (то есть назначаются препараты с возможным охватом широкого спектра микроорганизмов), при получении результатов добавляется препарат, специфически действующий именно на клебсиеллу. Нередко антибиотики стартовой группы и специфического лечения совпадают. На практике используются: полусинтетические пенициллины, цефалоспорины 3-4 поколений, аминогликозиды, тетрациклины, иногда фторхинолоны. Препарат подбирается только врачом во избежание ошибок назначения и формирования устойчивых штаммов клебсиелл.

3) Патогенетическая терапия (направлена на снижение лихорадки, интоксикации, профилактики возникновения и ликвидации осложнений инфекции).

4) Посиндромальная терапия (также могут назначаться пробиотики, противорвотные препараты, отхаркивающие средства, травяные сборы) в зависимости от формы инфекции и ведущего синдрома.

Неспецифическая профилактика (вакцина) в настоящее время не разработана. Профилактические мероприятия сводятся к гигиеническому воспитанию детей, укреплению иммунитета, своевременному лечению хронических заболеваний и инфекций.

1.2.2. Препараты бактериофагов и их эффективность при лечении гнойно-септических и инфекционных заболеваний

Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно - профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерия, холера, различные гнойно-воспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные, используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонеллезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний). Бактериофаги применяются также в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция). Как правило, таким больным назначаются антибиотики. Но в связи с тем, что постоянно мутирующие бактерии приобретают устойчивость к антибиотикам, их эффективность за последние годы ослабла. Внимание исследователей привлекли бактериофаги - вирусы, пожирающие бактерии. В отличие от антибиотиков, которые уничтожают как вредную, так и здоровую микрофлору организма, бактериофаги избирательны, под их воздействие попадают только патогенные бактерии. Как действуют бактериофаги в организме? Они проникают только в определенные клетки и взаимодействуют с их ДНК, создавая лизогенный или литический эффект. Воздействуя на микробы при литическом типе, бактериофаги уничтожают их, что позволяет им быстро размножаться. Лизогенный тип представляет собой проникновение генома фага в геном бактерии, их синтез и дальнейший переход из одного поколения в другое. Информация о бактериофагах появилась больше века назад при использовании их для лечения стафилококка. В настоящее время они широко используются для профилактики и лечения кишечных, стафилококковых, стрептококковых, тифозных и многих других инфекций. Современная медицина ищет методы, при которых используются не живые бактериофаги, а ферменты, воздействующие на патогенные бактерии лизированием. Их применение может быть в виде назального или орального спрея, зубной пасты, продуктов питания, пищевых добавок. Эффективность применения бактериофагов состоит в отсутствии противопоказаний и осложнений, сочетаемости с другими лекарствами, активном воздействии на антибиотико-устойчивые микробы. Благодаря этим свойствам, бактериофаги оценены как препараты будущего для успешной борьбы с инфекциями.

Важнейшими достоинствами фаготерапии являются высокая чувствительность патогенной микрофлоры к бактериофагу, возможность первоначального применения небольших доз бактериофага, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии. (Лазарева Е.Б., 2003; Ворошилова Н. Н. и др., 2008.)Установлено, что в природе не существуют микроорганизмы, абсолютно устойчивые к бактериофагу. Важно, что размножение бактериофага возможно лишь в присутствии чувствительных к нему бактерий. После гибели последней микробной клетки в очаге инфекционного поражения он прекращает свою активную деятельность и бесследно выводится из организма.

В связи с наблюдаемым снижением терапевтического действия антибиотиков препараты бактериофагов используются в клинической практике как альтернатива антибиотикам и в сочетании с последними. Препараты бактериофагов не уступают антибактериальным препаратам по эффективности, стимулируют местные факторы специфического и неспецифического иммунитета и не вызывают при этом побочных токсических и аллергических реакций. Бактериофаги назначают внутрь, а также используют для орошения ран, для введения в дренированные полости - брюшную, плевральную, полости пазух носа, среднего уха, абсцессов, ран, матки, мочевого пузыря. При пероральном и аэрозольном применении, а также при нанесении на поверхность слизистых оболочек бактериофаги проникают в кровь и лимфу и выводятся через почки, санируя мочевыводящие пути.

В настоящее время возобновился интерес к фаготерапии в хирургии, урологии, офтальмологии, травматологии. (Алешкин, А.В. Фагобиотики в профилактике кишечных инфекций/ А.В. Алешкин, С.С. Афанасьев, Э.А. Светоч, Н.В. Воложанцев // Материалы VI Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. – Москва, 2014. – С.28).

Лечебно-профилактические препараты бактериофагов составлены из поликлональных вирулентных бактериофагов широкого диапазона действия, активных и в отношении бактерий, устойчивых к антибиотикам. Их выпускают в жидком виде, в таблетках с кислотоустойчивым покрытием, в виде свечей, мазей, линиментов.

Препараты бактериофагов представляют собой стерильный фильтрат бактериальных фаголизатов, их назначают внутрь, местно для орошения ран и слизистых, введения в полости матки, мочевого пузыря, уха, придаточных пазух, а также в дренированные полости - брюшную, плевральную, а также в полости абсцессов после удаления экссудата.

Бактериофаги способны быстро проникать в кровь и лимфу и выводятся через почки с мочой. Как показано в наших исследованиях, после приема 30 мл бактериофага уже через 2 часа фаговые частицы обнаруживаются в моче, а максимальная концентрация их в моче достигается через 6-8 часов после приема.

Активность лечебно - профилактических бактериофагов в отношении возбудителей гнойно-септических и энтеральных заболевании достаточно высока - от 72 % до 90%, в том числе и в отношении штаммов госпитального происхождения, характеризующихся множественной устойчивостью к антибиотикам. Соответствие препаратов бактериофагов современной этиологической структуре возбудителей достигается их постоянной адаптацией к циркулирующим штаммам за счет обновления фаговых рас и производственных бактериальных штампов. Эта особенность выгодно отличает фаги от других антимикробных препаратов - антибиотиков, эубиотиков или вакцин, где производственные штаммы или штаммы-продуценты, или синтезированное вещество не подлежат каким-либо модификациям. Такая пластичность бактериофаговых препаратов обеспечивает продолжение пе