Применение ферментов в пищевой технологии. Иммобилизованные ферменты. Ферментативные методы анализа пищевых продуктов

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ В ПИЩЕВЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ

Ферментные препараты в отличие от ферментов содержат помимо активного фермента множество балластных веществ, в том числе и других белков. Кроме того, большинство ферментных препаратов являются комплексными, т. е. кроме основного фермента, имеющего наибольшую активность, в его состав входят другие сопутствующие ферменты. Однако существуют препараты и индивидуальных ферментов.

Название ферментного препарата включает название основного фермента и название микроорганизма-продуцента, с окончанием "-ин". Например: амилоризин — основной фермент — амилаза, продуцент Aspergillus oryzae; протосубтилин — основной фермент — протеаза, продуцент Bacillus subtilis. Помимо этого, в названии обязательно отражается способ культивирования микроорганизма: Г — глубинное; П — поверхностное, а также степень очистки — X (2Х; ЗХ; 10Х; 15Х; 20Х). Применение ферментных препаратов в отраслях пищевой промышленности позволяет интенсифицировать технологические процессы, улучшать качество готовой продукции, увеличивать ее выход, а также сэкономить ценное пищевое сырье. Ферментные препараты должны удовлетворять требованиям, предъявляемым конкретными технологиями не только по типу катализируемой реакции, но и в отношении условий их действия: рН, температуры, стабильности, присутствия активаторов и ингибиторов, т. е. тех факторов, которые обуславливают эффективность действия препарата в данной среде и позволяют правильно определить технологические режимы его применения. В зависимости от цели применения к ферментным препаратам предъявляются определенные требования не только в отношении состава ферментов и оптимальных условий их действия, но и в отношении степени очистки, применяемых наполнителей, стоимости и ряда других параметров. Очень важным моментом является оценка безопасности ферментных препаратов, и в первую очередь это касается микробных ферментных препаратов, которые требуют тщательного химического, микробиологического и токсикологического контроля. Особое место занимают ферментные препараты, получаемые из генетически модифицированных микроорганизмов. Основными ферментными препаратами, полученными методами генной инженерии и разрешенными к применению в пищевой промышленности, являются:?-амилаза из В. stearothermophilys, экспрессированная в В. subtilis;?-амилаза из В. megaterium, экспрессированная в В. subtilis; химозин А, полученный из штамма Е. coli К-12, содержащего ген телячьего прохимозина А. В настоящее время в мире производится большое количество ферментных препаратов для разных отраслей пищевой промышленности, применяемых на различных стадиях технологического процесса. Различные фирмы выпускают ферментные препараты под разными коммерческими (торговыми) названиями. Однако работа по поиску новых продуцентов, созданию новых препаратов пролонгированного действия, очистке ферментных препаратов, повышению их стабильности и т. п. ведется весьма интенсивно.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
Ферментативный анализ представляет собой один из основных аналитических инструментов в международной и отечественной практике научных исследований, современного производственного и сертификационного контроля качества продуктов питания, пищевого сырья и биологических материалов.
Ферментативный анализ является составной частью энзимологии и аналитической химии и служит для специфического определения веществ с помощью высокоочищенных препаратов ферментов.

В основе ферментативного анализа лежат природные биохимические процессы обмена веществ, которые воспроизводятся in vitro: реакция фермента с субстратом, причем в качестве субстрата выступает анализируемое вещество пробы.
Основными преимуществами применения ферментативных методов в научных исследованиях, при разработке новых пищевых технологий и биотехнологических процессов, а также при анализе качества, идентификации и установления фальсификации продуктов питания и пищевого сырья являются:
1. Высокая специфичность и достоверность результатов. Высокоспецифичные ферментативные методы анализа дают, как правило, более достоверные результаты, чем неспецифические химические методы. Специфичность действия ферментов, основанная на комплементарное™ пространственной конфигурации активного центра и субстрата является гарантом достоверности и надежности ферментативного метода при исследовании отдельных соединений в многокомпонентных смесях, имеющих сложный состав и строение, таких, какими и являются пищевые продукты. При разработке ферментативных методов и подборе реагентов, в первую очередь, выбирают ферменты с наибольшей специфичностью действия, для которых подбираются оптимальные условия проведения анализа. Кроме того, при разработке методов ферментативного анализа отдельных компонентов продуктов питания обычно используют несколько ферментов, которые последовательно функционируют в данной системе.
2. Простые способы подготовки проб, которые исключают потерю исследуемых компонентов. Основная задача, которую необходимо выполнить при подготовке пробы, — по возможности наиболее полно сохранить для анализа исследуемый компонент без его количественной потери или изменения структуры. В некоторых случаях возможен прямой анализ пробы без ее предварительной подготовки (например, при абсолютной специфичности фермента к исследуемому веществу и отсутствии в пробе каких-либо мешающих факторов). Обычно же для ферментативного анализа используются простые и хорошо известные способы подготовки проб, такие как: разбавление, фильтрация (центрифугирование), нейтрализация (подкисление), экстракция, обезжиривание, осветление, обесцвечивание. Только в определенных случаях применяют специальные способы подготовки проб, например, при определении водонерастворимых соединений (холестерин, лецитин, крахмал), нестабильной L-аскорбиновой кислоты в твердых материалах и др.
3. Простая и быстрая процедура измерений, которая исключает использование дорогостоящего оборудования. В большинстве ферментативных определений используют фотометрические способы измерения результатов. Для этого все компоненты искусственной тестовой системы, например, буфер, коферменты, активаторы, вспомогательные ферменты и пробу смешивают в фотометрической кювете. После измерения начальной оптической плотности добавляют стартовый фермент, который инициирует реакцию. В конце реакции (через определенный промежуток времени) повторно измеряют оптическую плотность тестовой системы. Из разницы оптических плотностей в начале и в конце реакции по уравнению закона Ламберта — Бера рассчитывают концентрацию С (г/л) искомого соединения.

1.Высокая чувствительность метода и хорошая воспроизводимость результатов. Высокая чувствительность позволяет использовать ферментативные методы для определения следовых количеств веществ. Например, в продуктах питания могут быть определены следующие концентрации компонентов (г/л): этанол — 0,001; ацетоальдегид — 0,001; лимонная кислота — 0,002; глицерин — 0,001; D-глюкоза — 0,002; D-сорбит — 0,001; лактоза — 0,005; нитраты — 0,001.
Кроме вышеперечисленных достоинств ферментативных методов анализа можно назвать и универсальность применения, высокую надежность и устойчивость к мешающим факторам, низкие затраты на проведение анализа (время, оборудование, расходуемые материалы), а также использование безопасных реактивов.
Области применения ферментативного анализа на практике многообразны. Это и производственный контроль, и контроль качества готовой продукции, а также контроль сырья, анализ состава пищевого продукта с целью установления их свойств и соответствия законодательным нормам, оценка гигиенического статуса, идентификация и установление фальсификации.

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ (от лат. immobiiis - неподвижный), препараты ферментов, молекулы к-рых связаны с матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом полностью или частично свои каталитич. св-ва. Иммобилизованные ферменты обычно не раств. в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктов каталитич. р-ции, ингибиторов и активаторов.

Коммерческое использование ферментов ограничено рядом факторов. Важнейшие из них - нестабильность ферментов и их высокая стоимость. Стоимость можно существенно снизить за счет иммобилизации фермента. Это означает, что фермент закрепляют на поверхности или внутри твердой подложки, которую легко удаляют из реакционной смеси после завершения ферментации. Фермент может быть использован повторно, что существенно снижает стоимость процесса.

Другое преимущество иммобилизации заключается в том, что фермент становится более стабильным, вероятно, за счет ограничения его способности денатурировать при изменениях рН, температуры и растворителей. К примеру, иммобилизованная глюкозоизомераза стабильна при 65°С в течение года, тогда как в растворе она денатурирует при 45 °С за несколько часов.

Иммобилизованный фермент можно использовать для непрерывного (открытого) производства, пропуская реагенты через фермент и собирая продукт на конечном этапе.