Методы выделения, очистки и количественного определения белков

Выделение белков:

Из ткани: гомогенизация (разрушение тканей и клеточных структур)

Из плазмы крови, мочи и др. биологических жидкостей гомогенизация не нужна

– осаждение белков (солями, спиртом или дегидратирующими растворами)

– фракционирование белков (ионообменная или гельпроникающая хроматография) Очистка. Существует много методов, рассмотрим детально гельфильтрацию и диализ.

Разделение белков по молекулярной массе (метод молекулярных сит) или отделение белков от низкомолекулярных веществ обычно ведут при помощи гельфильтрации. При гельфильтрации первыми из колонки выходят белки (или вещества) с большей молекулярной массой, которые не заходят в середину гранул, а позже из колонки выходят вещества з небольшой молекулярной массой, которые застревают в порах геля.

Диализ – это метод очистки белков от низкомолекулярных примесей. Маленькие молекулы проходят через полупроницаемую мембрану, а белки, имеющие большую молекулярную массу не проходят через нее.

Колич опред Б: 1) по содержанию в них азота (для этого белковый препарат сначала подвергают минерализации, а затем опред содерж азоту по реакции Несслера); 2) биуретовый метод – основан на образовании окра шенных в синефиолетовый цвет комплексов между ионами меди и пептидными связями белков;3) метод Лоури, кот основан на способности медных комплексов Б восстанавливать реактив Фолина; 4) метод Бредфорда, кот основан на способности Б связывать краси тели – бромфеноловый синий, кумасси голубой; 5) м опред Б по их взаимод с коллоидным р-ом высокодисперсного кремнезема.

Качественное определение белков используются осадочные пробы с органич к-

ми (трихлоруксусная, сульфосалициловая кислоты), цветные реакции на определенные аминокислоты в составе белка (реакция Фоля, ксантопротеиновая реакции и др).