Системы ДНК-диагностики

Информация обо всем многообразии свойств ор­ганизма заключена в его генетическом материа­ле. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набо­ра генов (гены вирулентности), а наследственное генетическое забо­левание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК, детермини­рующий данный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последова­тельность и может служить надежным диагностическим маркером.

В основе многих быстрых и надежных диаг­ностических методов лежит процесс гибридизация нук­леиновых кислот - спаривание двух компле­ментарных одноцепочечных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следую­щем.

1. Разрушение биологического образца (клетки, ткани), выделение молекул ДНК

и их разрушение до одноцепочечных фрагментов.

2. Фиксация одноцепочечной ДНК - мишени на твердой подложке, например

мембранном фильтре или на поверхности лунки.

3. Обработка подложки раствором, содержащим меченые одноцепочечные

молекулы ДНК-зонда, которая при определенных условиях (температуре и рН раствора) спаривается с ДНК-мишенью.

4. Промывка фильтра для удаления избытка несвязавшихся молекул ДНК-зонда.

5. Детекция гибридных молекул ДНК-зонд/мишень.

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевы­ми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК-мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. Система детекции должна быть в выс­шей степени специфичной и высокочувстви­тельной.

Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образ­цы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК-мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности-мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифицировать (увеличить,наработать) с помошью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Получены и охарактеризованы более 100 раз­личных ДНК-зондов, позволяющих обнаружи­вать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. Так, име­ются зонды для диагностики бактериальных ин­фекций человека, вызываемых Legionella pneumophila (респираторные заболевания), Salmonellatyphi (пищевые отравления), Campylobacter hyoin-testinalis (гастриты), а также для выявления энтеротоксичного штамма Escherichia coli (гастроэн­териты). Однако это лишь «верхушка айсберга»; в принципе с помощью гибридизации можно вы­являть практически любые патогенные микроор­ганизмы.