Расщепление химерных белков

В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может исполь­зоваться как таковой или в составе химерного белка, причем последний вариант встречается нечасто. Это объясняется тем, что, из-за присутствия фрагмента хозяйского белка большинство химерных белков оказываются непригодными для применения в клинике в следствии высокой алергенности или низкой активности. Кроме то­го, для химерных белков предусмотрена более сложная процедура тестирования, которую они должны пройти, чтобы получить разрешение к применению у соответствующих организаций. Все это заставляет искать способы удаления лишних аминокислотных последовательностей из молекулы получаемого продукта.

Один из таких способов основан на присоединении бел­ка, кодируемого геном-мишенью, к белку клет­ки-хозяина через короткий полипептид, распознаваемый специфической протеазой не­бактериального происхождения. Такое присое­динение тоже программируется на уровне ДНК. Олигонуклеотидные линкеры, несущие сайты для протеаз, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введе­на в экспрессирующую векторную систему сли­яния. Линкером может служить, например, олигонуклеотид, кодирующий пептид Ile-Glu-Gly-Arg. После синтеза, выделения и очистки химерного белка для отделения белкового продукта, коди­руемого клонированным геном можно исполь­зовать фактор свертывания крови Х_а, который является специфической протеазой, разрыва­ющей пептидные связи исключительно на С-конце последовательности Ile-Glu-Gly-Arg. Поскольку такой пептид встречается в природных белках довольно редко, этот подход можно использовать для отделения различных продуктов, кодируемых клонированными генами.

Белок хозяина - CONH-Ile-Glu-Gly-Arg-CONH - клонируемый белок

Химерные белки используются не только для стабилизации полипептидов, но и для упроще­ния процедуры очистки рекомбинантных белков. Так, плазмидная конструкция Saccharomyces cerevisiae, содержащая ген челове­ческого интерлейкина-2 с присоединенным к не­му сегментом ДНК, кодирующим маркер-ный пептид Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-, выполняет двоя­кую функцию: обеспечивает стабилизацию про­дукта гена интерлейкина-2 и облегчает его очист­ку. Интерлейкин-2 - это биологический фактор, стимулирующий рост Т-клеток и синтез В-кле­точных антител. Химерный белок, образующий­ся после экспрессии этой генетической конст­рукции в дрожжевых клетках, может быть очищен за один прием с помощью иммуноаффинной хроматографии. Для этого моно-клональные антитела к маркерному пептиду фиксируют на полипропиленовом носителе и пропускают через колонку химерный белок, который связы­вается с этими антителами. Маркерный пептид - небольшая молекула, на его образова­ние расходуется лишь малая часть клеточных ресурсов. Химерный белок обладает такой же биологической активностью, что и природный интерлейкин-2. Однако для применения в клинике маркерный пептид удаляют.