Лабораторная диагностика классической чумы свиней

Классическая чума свиней (КЧС) - высококонтагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтерическим воспалением толстого кишечника. Группа А по данным МЭБ.

К ВКЧС восприимчивы домашние свиньи всех пород и возрастных групп, особенно чистопородные, а также дикие кабаны.

Болезнь регистрируется главным образом в Азии, Центральной и Южной Америке, а также в некоторых регионах Европы и Африки.

Вирус чумы свиней относится к семейству Flaviviridae, род Pestivirus. Вирусную природу КЧС установили в 1908 г. Швейнитц и Дорсе.

Антигенная вариабельность ВКЧС не доказана. По вирулентности различают А-, В- и С -варианты вируса. В группу А входят вирулентные эпизоотические штаммы, вызывающие у свиней всех возрастов остро протекающую болезнь. Вирусы подгруппы В вирулентны только для поросят и при циркуляции в стаде вызывают атипичную или хроническую чуму.
Подгруппа С – американский слабовирулентный шт. 331.
Установлено одностороннее родство между ВКЧС и вирусом диареи КРС: АТ к вирусу диареи КРС нейтрализуют ВКЧС, но АТ к ВКЧС не нейтрализуют вируса диареи. В сыворотке крови свиней-реконвалесцентов обнаруживают ВНА, ПА и КСА.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований. Эпизоотологические и патологоанатомические данные зависят от восприимчивости свиней, вирулентности штамма и комплекса мероприятий по профилактике КЧС.

Если в очаге штамм вируса вирулентный, поголовье свиней не иммунное, то болезнь характеризуется высокой контагиозностью, большей смертностью, гипертермией, геморрагическими поражениями кожного покрова, признаками поражения органов ЖКТ и ЦНС. Обращают внимание выраженный геморрагический диатез в различных органах, мраморность лимфоузлов, инфаркты селезенки, кровоизлияния в почках на фоне их анемии, катарально-геморрагический гастроэнтерит, лимфоцитарный энцефаломиелит. Однако частая вакцинация свиней против чумы создает иммунный фон, влияющий на симптомы болезни и характер патоморфологических изменений. При хроническом течении характерными изме­ниями являются очаговый дифтеритический налет (бутоны), коричневая экзема, фибринозный плеврит и перикардит, некроз миндалин. Хроническая болезнь часто протекает на фоне других инфекций. Правильный диагноз может быть поставлен только лабораторными исследованиями.

Экспресс-методы обнаружения вируса КЧС. Рекомендована дифференциация пестивирусов с использованием ДНК-зонда на ВКЧС. В качестве гибридизационного зонда используют комплементарную ДНК (меченую ³²Р) к участку гена белка Р125. Для быстро-D обнаружения ВКЧС в тканях с помощью ПЦР из образцов тканей животных фенольным дом выделяют препараты РНК, подвергают обратной транскрипции и амплифицируют ПЦР. Используемые "гнездовые" праймеры позволяют амплифицировать разные изоляты ВКЧС. ПЦР обладает высокой чувствительностью и специфичностью и позволяет дифференцировать различные пестивирусы. Предложен вариант ПЦР для выявления ВКЧС с использованием 4-х праймеров для амплификации фрагментов гена белка

Е-1. Чувствительность метода составляет 10 ТЦД₅₀.

Выделение вируса. Для выделения вируса берут пробы крови, кусочки селезенки, миндалин, лимфоузлов, грудной кости, почек и легких от 2-3 животных в первые 2ч после гибели или убоя больных в атональном состоянии. Материал отбирают в стерильные флаконы, закрывают резиновыми пробками, флаконы обрабатывают снаружи 5%-ным р-ром хлорамина или осветленным 20%-ным р-ром хлорной извести, обертывают марлей, смоченной дезинфицирующим р-ром, и помещают в полиэтиленовый пакет. Взятый патматериал помещают в термос со льдом, опечатывают и отправляют с нарочным в лабораторию с сопроводительным документом. В лаборатории из каждой пробы готовят 20%-ную суспензию на 0,85%-ном р-ре NaCl, которую трижды замораживают и оттаивают, центрифугируют при 3-4 тыс. мин-¹ 20-30 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают антибиотиками 1ч при 37°С и используют для выделения вируса.

Выделение вируса в культуре клеток. Используют перевиваемую культуру клеток РК-15, выращенную на стеклянных пластинках. На каждую пробу материала берут не менее 8 пробирок, в которые вносят по
0,4 мл исследуемого материала. Адсорбируют вирус 2 ч 137°С, затем его удаляют, клетки отмывают средой и заливают 2 мл поддерживающей среды с 2% сыворотки теленка. Для контроля качества культуры клеток оставляют 10 пробирок незаряженными. Инкубируют 24-96 ч. ВКЧС в культуре клеток РК-15 не вызывает, поэтому индикацию его проводят методом прямой ИФ. Через 24-96 ч после инокуляции пластинки с монослоем клеток извлекают из пробирок, подсушивают на воздухе и 10 мин фиксируют в холодном (4°С) ацетоне, подсушивают на воздухе и помещают их клетками вниз на капле ФИТЦ-Ig ВКЧС, нанесенного в рабочем разведении на предметные стекла. Препараты выдерживают во влажной камере 30 мин при 37°С, затем промывают в сосуде с 0,01 M ФСБ с рН 7,2-7,5 30-40 мин в темном месте, ополаскивают в дистиллированной воде, подсушивают на воздухе и заключают в забуференный глицерин (9 частей глицерина и 1 часть 0,01 М ФСБ с рН 7,5). Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят кап­лю забуференного глицерина, помещают препарат клетками вниз и заливают края расплав­ленным парафином, Просматривают под люминесцентным микроскопом.

В инфицированных препаратах, обработанных ФИТЦ-Ig, АГ вируса обнаруживают по ярко-зеленому диффузному свечению цитоплазмы пораженных клеток, располагающихся группами, которые называют флюоресцирующими микробляшками. Через 24-48 ч в культу­ре клеток РК-15 наблюдают появление микробляшек. При их отсутствии в первом пассаже проводят 2-й и 3-й пассажи испытуемого материала с последующим ИФ через 24-96 ч.

Индикация и идентификация вируса. Гистологические исследования. Проводят с целью обнаружения специфических изме­нений нервных тканей. От павших или убитых свиней берут кусочки полушария головного мозга, мозжечка, аммоновых рогов, спинного мозга в различных участках. Гистологические препараты окрашивают гематоксилин-эозином. В большинстве случаев (70-93%) в ЦНС об­наруживают негнойный лимфоцитарный энцефаломиелит, характеризующийся периваскулярными лимфоцитарными инфильтратами, очаговой пролиферацией клеток микроглии (глиальных узелков) и дистрофией ганглиозньгх клеток. B срезах, приготовленных из лим­фоузлов, сердечной мышцы и печени, можно обнаружить присутствие ацидофильных внут­риядерных телец-включений, несколько меньших, чем ядрышки. В лимфоузлах их находят на 6-12-й день после заражения.

ВКЧС обладает выраженным гематотропизмом в отношении костного мозга, содержа­щего большее количество бластных клеток, чем лимфоузлы и селезенка. Поэтому костный мозг поражается первым; ингибируются миелопоэтические и эритропоэтические клетки и пролиферируют крупные клетки с базофильной цитоплазмой. Наряду с этим обнаруживают картину глубокого цитолиза и дистрофию лимфопоэтических органов.

При подозрении на чуму для уточнения диагноза несколько тяжелобольных животных убивают и исследуют мазки из костного мозга грудной клетки.

Биопроба. Из благополучного по инфекционным болезням хозяйства берут поросят в возрасте 2-3 мес массой 20-30 кг. В качестве материала используют 10%-ную суспензию, приготовленную из органов (селезенки, лимфоузлов, костного мозга) или крови от павших животных. Суспензию обрабатывают антибиотиками, выдерживают не менее 4 ч при 4°С, центрифугируют и надосадочную жидкость используют для заражения животных. Трем по­росятам вводят подкожно по 1 мл крови или по 2 мл суспензии органов. Двум животным исследуемый материал не инокулируют, содержат их отдельно для контроля. Двум порося­там, иммунным к ВКЧС, вводят исследуемый материал в тех же дозах с целью дифферен­циальной диагностики в отношении АЧС. За всеми животными наблюдают 21 день и еже­дневно измеряют температуру тела.

Диагноз считают положительным, если 2 из 3-х неиммунных поросят заболевают, про­являя симптомы болезни, и погибают, а 2 иммунных остаются здоровыми или проявляют незначительные и кратковременные (1-4 дн) признаки болезни слабой интенсивности (повышение температуры тела не выше 41°С). Однако следует иметь ввиду, что при отсут­ствии реакции у восприимчивых животных или в случае ее недостаточной выраженности, нельзя с уверенностью исключить присутствие вируса в исследуемом материале. Отрица­тельный результат заражения может быть следствием либо слишком малого количества в нем вируса, либо слабой вирулентности последнего. Поэтому следующим шагом является повторное, спустя 3-6 нед после инокуляции исследуемого материала, заражение (реинфекция) подопытных свиней на этот раз вирусом с заведомо известной вирулентностью. Отсут­ствие у животных реакции на это заражение свидетельствует о приобретении ими иммуни­тета в результате первой инокуляции (бессимптомного переболевания) и косвенно указывает на присутствие вируса в исследуемом материале. Одновременно с проведением второй пробы заражают дополнительно двух восприимчивых поросят (контроль) вирусом, использо­ванным для реинфекции.

Иногда биологическая проба себя не оправдывает или дает неясные результаты при вы­делении штаммов вируса, вызывающих легкое заболевание. Такие штаммы у инокулированных поросят вызывают хроническую болезнь. Дело осложняется тем, что штаммы со слабой вирулентностью могут не обладать иммунизирующими свойствами, а это не позво­ляет уточнить диагноз при использовании дополнительного контрольного заражения виру­лентным штаммом (реинфекции). При диагностике заболевания, обусловленного такими штаммами могут понадобиться молодые животные и дополнительные пассажи для повышения вирулентности.

Предложена шкала оценки вирулентности полевых штаммов ВКЧС:

- слабовирулентные (патогенные лишь для поросят-сосунов) не иммунизирующие штаммы. Поросята-сосуны заболевают в первые дни жизни и смертность их велика, поросята-отъемыши (12-15 кг) реагируют только в определенные дни подъемом температуры тела, не приобретая иммунитета;

- слабовирулентные (патогенные для молодых животных) иммунизирующие штаммы. У животных массой 15-20 кг развивается хроническая болезнь, подсвинки массой 35 кг реаги­руют подъемом температуры тела, продолжающимся несколько дней. На вскрытии обнару­живаются незначительные точечные кровоизлияния. Животные приобретают иммунитет;

- сильно вирулентные штаммы вызывают у животных массой 30 кг острое заболевание, смертность 40% и больше. На вскрытии характерны геморрагические изменения.

Тест модуляции фагоцитарной активности макрофагов. Дефицит фагоцитарной функции приводит к нарушению локальных иммунных реакций с развитием воспалитель­ных процессов на слизистых оболочках. При КЧС происходит локализация фагоцитарной функции лейкоцитов: при репродукции вакцинного шт. ЛК-ВНИВВиМ снижается процент и индекс фагоцитоза нейтрофилов и макрофагов, а при репродукции вирулентного вируса шт. Ши-Мынь повышается процент и индекс фагоцитоза нейтрофилов и снижается таковой у макрофагов. При КЧС in vivo и in vitro фагоцитарная активность лейкоцитов крови кратко­временно (до 4 сут) снижается при инфицировании вакцинным штаммом и повышается у макрофагов при инфицировании вирулентным штаммом ВКЧС. Установленный в инфици­рованных клетках-мишенях цитопатический эффект, выражающийся в модуляции фагоци­тарной активности свиных макрофагов, используют в диагностике КЧС.