Полезное:
Как сделать разговор полезным и приятным
Как сделать объемную звезду своими руками
Как сделать то, что делать не хочется?
Как сделать погремушку
Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами
Как сделать идею коммерческой
Как сделать хорошую растяжку ног?
Как сделать наш разум здоровым?
Как сделать, чтобы люди обманывали меньше
Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили?
Как сделать лучше себе и другим людям
Как сделать свидание интересным?
Категории:
АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника
|
Серологическая идентификация. РСК. Все ранее выделенные эпизоотические штаммы ВГС относятся к типу АРСК. Все ранее выделенные эпизоотические штаммы ВГС относятся к типу А. Однако это не исключает возможности обнаружения вируса гриппа иной типовой принадлежности, поэтому тип выделенных вирусов определяют в РСК. Данную реакцию используют при выделении вируса, идентификация которого не удается с помощью РТГА. В этом случае в РСК с эталонными иммунными сыворотками против гриппа типов А, В и С устанавливают типовую принадлежность выделенного вируса. В Ленинградском институте им. Пастера предложена усовершенствованная методика РСК для идентификации вирусов гриппа, в которой используют иммунные типовые сыворотки морских свинок (коммерческие лошадиные типоспецифические сыворотки для этой цели непригодны). В РСК применяют две дозы комплемента. Использование в реакции сыворотки морской свинки и аллантоисного АГ не требует титрования комплемента в их присутствии, так как они не обладают антикомплементарными свойствами. При идентификации вирусов гриппа РСК не заменяет РТГА, Позволяя установить типовую принадлежность штаммов, РСК не вскрывает различий между ними. ИФ. ИФ (прямой и непрямой варианты) используют для быстрого обнаружения АГ вируса в патологическом материале и в биологических системах, в которых проводят выделение вируса (КЭ, лабораторные животные, культура клеток). Локализация вирусного АГ характеризуется вначале нежной диффузной флюоресценцией в ядре, затем в перинуклеарной зоне. Постепенно мелкогранулярное свечение распространяется по всей цитоплазме, а внутриядерное - ослабевает. Методика постановки ИФ общепринятая. РТГА. Идентификацию выделенного на КЭ вируса проводят с набором штаммоспецифических сывороток с использованием эритроцитов кур. РТГА ставят по общепринятой методике. Сыворотка, задерживающая РГА до разведения не меньше четверти ее гомологичного титра, соответствует типу вируса. Например, РТГА со штаммами:
В данном примере штаммы № 2 и 3 принадлежат к БГС типа А и родственны штамму № 1, так как сыворотка к этому штамму нейтрализует ГА активность штаммов 2 и 3 соответственно до 0,25 и 0,5 своего гомологичного титра (1:320). РН. Ставят, главным образом, в КЭ, где хорошо размножаются вирусы гриппа. Применение ее на мышах весьма ограничено ввиду того, что немногие штаммы вируса гриппа патогенны для мышей. РН может быть поставлена в 2-х вариантах по общепринятой методике. ИФА. Вирусспецифические АГ выявлялись в ИФА в цитоплазме ФКЭ и клеток эпителия дыхательного тракта мышей в виде гранул желтого цвета. Установлена высокая чувствительность метода. Недавно иммуноферментная методика модифицирована. Стало возможным использовать ее для выявления ГА вируса гриппа как в составе вирусных частиц, так и в изолированном из вирионов состоянии. Модификация основана на прямой адсорбции вирионов гриппа и вирусспецифических белков на полистироловых гранулах. Определены параметры тест-системы для реализации ее максимальной чувствительности. Эффективность выявления ГА зависит от сорбционных свойств ГА содержащих вирусных препаратов. Для интактных вирионов гриппа максимальная чувствительность тест-системы равна 1-2 нг ГА в образце. Разработан экспресс-вариант методики, позволяющий выявить 30-40 нг ГА в образце при полной продолжительности анализа около 4 ч. Метод молекулярной гибридизации. Применяют для анализа носоглоточных смывов, полученных от заболевших в период эпидемиологического подъема заболеваемости гриппом, что позволяет рекомендовать его для использования в эпизоотологическом анализе. С помощью РТГА с использованием наборов монАТ, метода ПЦР и секвенирования ее продуктов, продемонстрирована высокая система АГ- и генетической консервативности ГА изолятов ВГС, полученных в 1986-1991 гг. Серодиагностика и ретроспективная диагностика. При ретроспективной диагностике важно выяснить, отмечалась ли циркуляция вируса гриппа у животных на данной ферме. Для этого исследуют кровь 10-20 свиней на присутствие анти-ГА. Начиная с 7-10-го дня после начала болезни в крови реконвалесцентов появляются AT. BHA у свиней появляются на 6-7-й день. Максимальный титр их обычно бывает между 14-м и 27-м да. РТГА. Обнаружение анти-ГА в крови переболевших животных - наиболее простой, достаточно точный и пригодный метод проведения единичных и массовых исследований при диагностике гриппа. Для этого при помощи РТГА определяют сдвиг специфических AT в парных сыворотках, взятых от животных в различные сроки после переболевания. Получают от каждого больного животного две пробы сыворотки: в первые дни болезни (1 проба) и в период реконвалесценции (2-я проба). Интервал между взятием 1-й и 2-й проб должен быть не менее 8-14 дн. Если в сыворотке, полученной от больных свиней в стадии выздоровления (через 14-30 дн после начала болезни), количество AT возросло по сравнению с исходным уровнем в 1-й сыворотке, взятой в первые дни болезни, в 4 раза и более, то это свидетельствует о том, что вспышка гриппа прошла. Анти-ГА в крови экспериментально зараженных поросят образуются во всех случаях на 8-10-й день, на 21-й день наблюдается некоторое снижение их титра, и к 40-му дню титры их в РТГА колеблются от 1:8 до 1:32. Сыворотки перед исследованием прогревают при 60°С 30 мин, освобождают от термостабильных ингибиторов (обработкой СО2) и неспецифических АГ (адсорбцией с помощью эритроцитов кур). РТГА ставят общепринятым методом с 4 ГАЕ вируса. Для удаления неспецифических ингибиторов из сывороток, содержащих AT к вирусу гриппа, в Румынии запатентован способ обработки, в котором используют фильтрат Clostridium welchii, позволяющий с большей надежностью получить сыворотки без ингибиторов, но сохранившие исходные концентрации специфических AT. Использование рекомбинантного вируса, устойчивого к неспецифическим сывороточным ингибиторам, позволяет исследовать сыворотки без их предварительной обработки. При сопоставлении чувствительности РТГА и ИФА была установлена их равноценность в выявлении числа сероконверсии к вирусам гриппа, однако величина титров AT, по данным РТГА, была в 2 раза ниже, чем в ИФА. РН. Ставят ее в монослойной культуре клеток, для чего используют адаптированный штамм с хорошо выраженным ЦПД. Испытуемые сыворотки инактивируют 30 мин, а для реакции используют 100 ТЦД50 вируса; смеси инкубируют при температуре 37°С 30 мин. При необходимости РН ставят и на КЭ по общепринятой методике. В США РН по подавлению бляшкообразования вирусами гриппа Al, A2 и В в перевиваемой линии клеток почек собак оказалась в 100 раз чувствительнее, чем РНГА. Перед постановкой реакции сыворотки разводят от 10-1 до 10-8 и инкубируют с 60-160 БОЕ индикаторного вируса гриппа в течение 1 ч при 34-36°С. Затем смеси вносят в чашки Петри с культурой клеток почек собак, выращенной в среде Игла при добавлении глутамина и нормальной телячьей сыворотки. На клетки наслаивают среду покрытия (среда Игла с 50% декстрозы, 1% декстрана и 0,1% трипсина), затем чашки в течение 2-5 дн инкубируют при 34-36°С в атмосфере с 5% СО2. К вирусу гриппа А1 чувствительна только 1-дн культура, а к вирусу А2 - 2-дн культура клеток почек собак. Указанная модификация РН удобна тем, что не требует освобождения сывороток от неспецифических ингибиторов и выявляла AT в сыворотках, в которых не удавалось обнаружить AT с помощью РТГА. РРГ. Более чувствительна, чем РТГА. Она была предложена для определения титра AT в сыворотках свиней, для чего из свежеотмытых эритроцитов цыплят готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буфере рН 7,2. Вирус гриппа А, выделенный от свиней (шт.А/свинья/Висконсин/15/30), в форме аллантоисной жидкости, содержащей 1024 ГАЕ в 0,05 мл, добавляют к равному объему суспензии эритроцитов. Смесь выдерживают 10 мин при 4°С, а затем дважды отмывают и ресуспендируют. Готовят расплавленную 1,5%-ную агарозу (А-37), содержащую 0,1% азида натрия. Затем к 4,5 мл суспензии эритроцитов с адсорбированным вирусом добавляют 1 мл комплемента и смешивают с 24,5 мл расплавленной и охлажденной до 45°С агарозой. После застывания среды вырезают луночки диаметром 3 мм. Каждую луночку заполняют исследуемой сывороткой и пластины выдерживают ночь во влажной камере при 4°С, а затем инкубируют 3 ч при 37°С. Испытуемые сыворотки перед исследованием инактивируют 30 мин при 56°С. О наличии AT к вирусу судят по образованию зоны лизиса вокруг луночек. Установлена корреляция титров AT в полевых и экспериментальных сыворотках, выявленных при использовании РРГ и РТГА. Описанный метод прост и быстро выполним. Неспецифическая ингибиция свиных сывороток снимается при прогревании. РРГ оказалась более чувствительной при выявлении AT к слабоавидным штаммам вируса А/Виктория/3/75 и В/Анон/2114/76. При правильном подборе штамма вируса РРГ может быть с успехом использована для определения антинейраминидазных AT при массовых обследованиях на грипп. РНГА. При серодиагностике гриппа эта реакция позволяет выявлять AT в значительно более высоких разведениях сывороток, чем РСК и РТГА (в 35 и 10 раз соответственно). Различия менаду показателями в РНГА и РН не превышали 1,1%. Благодаря высокой чувствительности РНГА давала возможность регистрировать сероконверсию раньше, чем другие серологические методы. ELISA применительно к гриппу свиней не разработан. РСК не нашла широкого практического применения из-за трудностей, связанных с прокомплементарными свойствами сывороток свиней. Дифференциальная диагностика. Трудность распознавания ВГС связана с тем, что вирусные респираторные болезни (инфекция Сендай, пневмонии хламидиозной природы, аденовирусная инфекция и пр.), а также микоплазмоз сопровождаются катаральными процессами в дыхательных путях. Атипичные формы гриппа свиней иногда могут протекать хронически и напоминают вирусную пневмонию свиней (весьма собирательный термин прошлого, под которым могут скрываться пневмонии разной этиологии). В последнее время установлено, что гриппоподобные болезни свиней могут быть обусловлены микоплазмами. Свинопоголовье может явиться как резервуаром для сохранения и возникновения эпидемических вариантов, так и промежуточным звеном в ходе эпидемического и эпизоотического процессов.
|