Серологическая идентификация

Для идентификации гриппа млекопитающих и птиц наиболее простым и высоко досто­верным методом является РТГА. РН - штаммоспецифическая и также высоко достоверная, но используется в диагностике значительно реже. Ее обычно применяют при некоторых не­ясных и спорных случаях.

Реакция связывания комплемента. Используют для определения типоспецифичности выделенного вируса, когда в РТГА не удается установить родственных связей между выделенным и эталонными штам­мами вируса гриппа по антисывороткам к ним. В этом случае в РСК с эталонными иммун­ными сыворотками против вирусов гриппа типов А, В и С устанавливают типовую принад­лежность штамма.

В последнее время для типирования нейраминидазы вируса начали применять РТНА, но в диагностической ветеринарной практике она пока еще не применяется. Ее используют, в основном, для изучения АГ связей различных штаммов вируса гриппа.

Реакция торможения гемагглютинации. Идентификацию испытуемого вируса проводят с набором эталонных штаммоспецифических гриппозных сывороток к его АГ вариантам. Для дифференциации в реакцию вводят сыворотку против вируса НБ. РТГА ставят микро- или макрометодом по общеприня­той методике.

Иммуноферментный метод. Может быть использована как экспресс-метод диагностики гриппа птиц. Препара­ты готовят непосредственно ex tempore от убитой больной или свежепавшей птицы. Прямой метод ИФ позволяет определять АГ ВГП в мазках-отпечатках тканей птиц, идентифициро­вать АГ данного вируса из различных тканей организма, инкубационных яиц, печени зара­женных эмбрионов и культур клеток фибробластов; выявить вирусный АГ даже в тех случа­ях, когда вирус из пораженных тканей выделить не удается.

В ветеринарной диагностической практике для идентификации выделенного вируса РДП не используют, так как необходимы концентрированные и очищенные АГ. В основном при­меняют ее для изучения АГ структуры вирусов гриппа. Разработаны наборы для ИФА с монАТ, непосредственно обнаруживающие ГА, нуклеокапсидный или матриксный белки виру­са гриппа. Идентификацию вирусспецифической нуклеиновой последовательности предла­гается осуществлять ПЦР с 2-мя типами праймеров (на основе генов неструктурного белка и ГА). Тест стандартизован для определения AT к ВГП в сыворотке крови у индеек.

Минимальные АГ различия между вариантами и родительским вирусом выявлялись только монАТ, продуцируемыми клетками гибридомы PEG-1 или фрагментами селезенки гипериммунных животных. МонАТ дают возможность точно проследить филогенетические взаимоотношения между вирусными штаммами в составе субтипа, а в сочетании с методами пептидного картирования и определения последовательности а.к. - выяснить молекулярную структуру АГ участка ГА.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Обнаружение анти-ГА, ВНА и КСА - надежный признак протекающей или уже прошедшей инфекции ГП в стаде.

РТГА. Исследование парных сывороток проводят с диагностической целью при ати­пичном, часто вялом течении болезни с поражением органов дыхания. Сыворотку от диких птиц на присутствие противогриппозных AT исследуют при изучении роли перелетных птиц в распространении гриппа. Обязательным условием для ретроспективной диагностики ГП является одновременное исследование парных сывороток, так как для диагностических це­лей имеет значение сравнительный титр AT против вирусов различных серологических под­типов в 1-й и 2-й пробах сыворотки. Первую пробу сыворотки хранят при 4°С или в замо­роженном виде. Обе пробы исследуют одновременно. Перед постановкой реакций сыворот­ки прогревают при 60°С 30 мин, а затем освобождают от термостабильных ингибиторов, используя СО₂, КО₄ и др. методы. Если титр AT во 2-й пробе сыворотки (через 10-14 дн после заболевания) превышает не менее чем в 4 раза титр AT к тому же типу вируса в 1-й пробе, то РТГА считается положительной, подтверждающей диагноз гриппа птиц. При по­становке РТГА с парными сыворотками больных птиц необходимо использовать не только набор эталонных штаммов (например, к вирусам A/Fowl plague, A/Chick/Scotland, A/Turkey, A/Duck), но и местные штаммы того птицехозяйства, где зарегистрирована болезнь. При анализе результатов РТГА необходимо указывать, сколько сывороток было с низким, сред­ним и высоким титром к тому или иному штамму вируса гриппа. В ряде случаев вместо ин­дивидуальных сывороток показатели иммунитета стада (после переболевания или прививки живой вакциной) можно изучить на сыворотках,.полученных от нескольких птиц. В этих случаях испытуемые сыворотки, взятые от отдельных птиц, нужно соединять в равных объ­емах. На протяжении опыта (120 дн после реконвалесценции) в сыворотках кур находили анти-ГА: до 75-го дня титры сохранялись примерно на одном уровне (5-5,8 log₂), а в даль­нейшем снижались (до 4,4-4,6 log₂).

РСК применяют для обнаружения АГ и AT в целях ранней и ретроспективной диагно­стики гриппа. Ставят с аллантоисными жидкостями КЭ или с очищенными диагностикумами. РДП широкого применения не нашла, так как необходимы высокие концентрации чис­тых АГ. Среди исследователей нет единого мнения о чувствительности этой реакции. Неко­торые авторы указывают, что чувствительность РДП сравнительно невысока, поскольку достоверные положительные результаты получали лишь при исследовании сывороток с тит­ром AT в РТГА 1:80 и выше.

Реакция радиального гемолиза. В настоящее время используется для сероэпидемио­логических исследований и при оценке эффективности противогриппозных вакцин. РРГ с ВГ А обладает выраженной штаммовой специфичностью: диаметр зон гемолиза с гомоло­гичными АГ при исследовании сывороток хорьков, зараженных 6-ю различными вирусами, были в 1,5-3 раза больше, чем с гетерологичными. При правильном подборе штамма РРГ может быть с успехом использована для определения анти-ГА.

Показано хорошее совпадение результатов титрования AT в ELISA, РСК и ИФ. Однако в ELISA значительно выше (титр 1:481-1:1520), чем в РСК и РИФ. Сенсибилизацию лунок панелей проводят РНК-АГ вируса гриппа А. Предложен новый метод приготовления AT эритроцитарных диагностикумов к вирусам гриппа, которые с успехом могут быть изготов­лены на основе любых штаммов вируса гриппа. Они позволяют определять типовую при­надлежность эпизоотических и межэпизоотических штаммов ВГП, свиней и лошадей. В практической работе врачу ветеринарной лаборатории, возможно, придется встретиться не только с гриппом кур и уток, но и с гриппом индеек.

Таблица 107 - Лабораторные методы дифференциации гриппа и ньюкаслской болези птиц

Умея диагностировать грипп кур и уток, имея набор диагностикумов, врач лаборатории при необходимости сможет поставить диагноз при гриппозной инфекции индеек.

При респираторных вирусных болезнях КРС, свиней и птиц (грипп, парагрипп, РС-инфекция) разработан направленный тест. Это новый иммуноферментный мембранный тест быстрого обнаружения вирусов гриппа в носоглоточных смывах. Чувствительность направ­ленного метода Flu-А составляла 90%. С помощью этого теста более легко обнаруживается клеточно-ассоциированный АГ, присутствующий в клинических пробах, чем свободный ви­рус. С помощью Flu-А теста удалось обнаружить вирусы гриппа А птиц (субтипы ГА Н3 и Н6) и свиней (H1N1) в клоачных смывах и гомогенатах.

Дифференциальная диагностика. КЧП (H7N1) и другие формы гриппа птиц следует отличать от НБ, ИБ, ИЛТ, гемофилеза и респираторного микоплазмоза. Для идентификации вирусов НБ и КЧП используется диагностический набор.

В сомнительных случаях для дифференциального диагноза ставят РН на КЭ и заражают птиц, иммунных к вирусу НБ.