Полезное:
Как сделать разговор полезным и приятным
Как сделать объемную звезду своими руками
Как сделать то, что делать не хочется?
Как сделать погремушку
Как сделать так чтобы женщины сами знакомились с вами
Как сделать идею коммерческой
Как сделать хорошую растяжку ног?
Как сделать наш разум здоровым?
Как сделать, чтобы люди обманывали меньше
Вопрос 4. Как сделать так, чтобы вас уважали и ценили?
Как сделать лучше себе и другим людям
Как сделать свидание интересным?
Категории:
АрхитектураАстрономияБиологияГеографияГеологияИнформатикаИскусствоИсторияКулинарияКультураМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОхрана трудаПравоПроизводствоПсихологияРелигияСоциологияСпортТехникаФизикаФилософияХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника
|
Выделение и идентификация хламидииДля изоляции хламидии могут быть использованы следующие биологические системы: мыши, морские свинки, куриные эмбрионы и культуры клеток. В диагностических лабораториях обычно используют три первые системы. С целью деконтаминации исследуемый материал растирают в стерильном физиологическом растворе (1:5), содержащем тиомерсал и канамицин 1:20 000, стрептомицин — 0,5 мкг/мл, центрифугируют суспензию при 4-5 тыс. об/мин 30 минут, отсасывают верхнюю половину надосадочной жидкости и выдерживают ее 16-18 часов при 4-6° С или 2-3 часа при комнатной температуре. Либо поступают следующим образом: готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе (рн 7,2-7,4), центрифугируют при 2000 об/мин 15 минут, в надосадочную жидкость добавляют стрептомицин (150 мкг/мл), пенициллин (100 ЕД/мл), выдерживают смесь 2-4 часа при 4-6° С. Материал из тканей кишечного тракта готовят в виде 10-15%-ной суспензии, кроме пенициллина и стрептомицина добавляют гентамицин (20 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл). С целью контроля наличия бактерий других групп материал высевают на МПБ и МПА, среду Кита-Тароцци. Заражение куриных эмбрионов. Яйца берут от кур, в рационе которых нет антибиотиков. Для заражения используют 6-7-дневные куриные эмбрионы. Скорлупу в зоне пуги дезинфицируют (70% этанол, 2% йод), прокалывают зондом. С помощью шприца 0,2-0,3 мл суспензии вводят в желточный мешок на глубину около 3 см. Отверстие заливают парафином. Заражают не менее 4-6 эмбрионов. Контроль за жизнеспособностью эмбрионов осуществляют методом овоскопии. Гибель эмбрионов в первые трое суток инкубирования считают неспецифической. В первом пассаже специфическая гибель обычно наступает на 8-11-е, а в последующих — на 6-8-е сутки инкубирования эмбрионов. Погибшие эмбри оны исследуют: после вскрытия скорлупы и оболочки воздушной камеры, захватывают стерильным пинцетом желточный мешок в области пупочного канатика, помещают в стерильную чашку Петри; оболочку отмывают от желтка стерильным физиологическим раствором, кусочком оболочки желточного мешка делают тонкие мазки на предметных стеклах, которые окрашивают одним из методов для обнаружения хламидий. Хламидии размножаются только в ткани желточного мешка. При отсутствии специфической гибели на 12-е сутки зараженные эмбрионы вскрывают, из желточных мешков готовят 10% суспензию, центрифугируют и центрифугатом заражают новую партию куриных эмбрионов. При получении отрицательных результатов (отсутствие специфической гибели) проводят до трех последовательных слепых пассажей. В случае необходимости адаптированные штаммы хламидий можно культивировать на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) и в аллантоис-ной жидкости. С целью пассирования в аллантоисной жидкости материал в дозе 0,3-0,4 мл вводят в аллантоисную полость 8-9-дневных куриных эмбрионов. Для заражения на хориоаллантоисную оболочку используют 10-12-дневные куриные эмбрионы. В положительных случаях на 3-6-е сутки на ХАО формируются узелки, состоящие из элементарных телец хламидий. Заражение в полость аллантоиса. Над воздушной камерой скальпелем прокалывают продезинфицированную скорлупу. Шприцом, на 2- Заражение на хориоаллантоисную оболочку. Скорлупу дезинфицируют и обрезают ножницами вокруг над воздушным пространством, пинцетом осторожно снимают небольшой кусочек подскорлуповой оболочки. На видимый участок хориоаллантоисной оболочки наносят материал, отверстие в скорлупе закрывают стеклянным колпачком и его края заливают парафином. Наличие хламидий устанавливают исследованием мазков из оболочек желточных мешков эмбрионов, павших на 4-12-й день после заражения, в любом из трех последовательных пассажей методом МФА, ПЦР, а также окраской одним из вышеперечисленных методов.
Заражение лабораторных животных. Действующей инструкцией по диагностике хламидиозов предусматривается внутрибрюшинное и интраторакальное заражение белых мышей и морских свинок. Белые мыши. Используют животных массой 16-20 г. Мыши чувствительны к внутрибрюшинному, интраназальному, торакальному и внутримозговому способам заражения животных. При отсутствии гибели животных на 10-е сутки после заражения убивают, из паренхиматозных органов готовят центрифугат 10% суспензии и проводят заражение очередной группы животных. В целом проводят три и более «слепых» пассажей. Внутрибрюшинно материал вводят в дозе 0,1-0,3 мл. В зависимости от степени вирулентности штамма хламидий животные заболевают и погибают на 5-10-е сутки. На вскрытии в положительных случаях в брюшной полости находят скопление серозно-фибринозного экссудата, небольшое увеличение селезенки и печени. Из этих органов делают мазки-отпечатки и подвергают исследованию с целью обнаружения и идентификации хламидий. Интраназально материал вводят в дозе около 0,05 мл в каждую ноздрю мышам (масса —12-16 г), находящимся под легким эфирным наркозом. Проводят до 3-6 «слепых» пассажей. Для заражения используют легочную ткань. Адаптированные штаммы вызывают гибель мышей на 4-6-е сутки. У погибших животных находят очаговую или лобарную пневмонию. Мазки-отпечатки для легочного исследования готовят из пораженных участков легких. В положительных случаях находят локализованные внутри- и внеклеточно элементарные тельца хламидий. Внутримозговое заражение. Используют молодых мышей массой 5- Интраторакальное заражение. Материал вводят мышам в объеме 0,3 мл через межреберные ткани с правой стороны. Морские свинки. Используют животных массой 250-300 г. До заражения пункцией сердца берут кровь для серологического исследования. Морские свинки наиболее чувствительны к внутрибрюшинному и интратора-кальному заражению. Материал вводят в объеме 0,5 мл. Симптомы болезни проявляются через 1-3 недели, наблюдается повышение температуры тела до 40-41° С. Погибает 80-100% зараженных животных, на вскрытии находят наложения фибрина на печени и селезенке. При отсутствии гибели целесообразно повторно взять пробы крови и провести исследования в РСК парных сывороток. Нарастание титра антител является достаточным основанием для постановки диагноза на хламидиоз, т.к. могут встречаться штаммы, не вызывающие гибели животных. При заражении куриных эмбрионов и любого вида лабораторных животных обнаружение и идентификацию хламидий в препаратах из органов и тканей биологических моделей проводят микроскопическим исследованием окрашенных тем или иным способом мазков-отпечатков, а также методом флуоресцирующих антител, иммуноферментным и при помощи ПЦР. Выделение хламидий на культуре клеток. Готовят раствор циклогексимида на изолирующей среде концентрацией 2 мкг/мл. Изолирующей средой называют среду с антибиотиками для заражения клеток исследуемым материалом: среда «Игла без глютамина» — 400 мл, 3%-ный раствор глютамина — 5 мл, фетальная сыворотка теленка — 8% (от общего объема), гентамицин — 40 мкг/мл, 10%-ный раствор глюкозы — 5 мл. В качестве ростовой среды применяют среду «Игла без глютамина» — 400 мл, 3%-ный раствор глютамина — 5 мл, фетальная сыворотка теленка — 4% (от общего объема), гентамицин — 40 мкг/мл. В стерильные плоскодонные пробирки с покровными стеклами вносят по 2 мл клеточной суспензии, инкубируют 24 часа при 37° С. В пенициллиновые флаконы с исследуемым материалом в транспортной среде (2 мл) добавляют 2 мл свежеприготовленной изолирующей среды (при интенсивном встряхивании). Из пробирок с монослоем клеток осторожно удаляют ростовую среду и заменяют ее изолирующей средой с исследуемым материалом (по 2 мл в две плоскодонные пробирки). Центрифугируют 60 минут при 3000 об/мин в центрифуге с горизонтальным ротором. Инкубируют 2 часа при 37° С. Удаляют изолирующую среду, вносят по 2 мл свежей изолирующей среды с циклогексимидом. Инкубируют материал 48-72 часа при Удаляют среду из пробирок, не нарушая монослоя, добавляют 1-2 мл метанола (по стенке пробирки), фиксируют 10 минут, осторожно встряхивают пробирки для ресуспензирования белкового осадка. Промывают фосфатным буфером (рН 6,8). В каждую пробирку вносят по 1 мл краски Романовского-Гимза на фосфатном буфере (1:9), через 30-60 минут краску удаляют, обработывают препарат 30% метанолом на фосфатном буфере. Покровные стекла высушивают, размещают в канадском бальзаме (монослоем вниз) на предметном стекле. Микроскопию препарата проводят в темнопольном микроскопе (х400-х600), включения хламидий дают желто-зеленую флуоресценцию. В сомнительных случаях исследуют препарат в обычном световом микроскопе с объективом х90. Микроскопическая картина: элементарные тельца имеют розовый цвет, ретикулярные—синий. Данный метод исследований является трудоемким, но чувствительным.
|