Выделение и идентификация свиных микоплазм

Культивирова­ние. Выделение культур M.hyopneumoniae проводят путем посева исследуе­мого материала в жидкие питательные среды, т.к. на плотных средах в первичных посевах данный вид микоплазм растет плохо. Образцы исследуемого материала реко­мендуют высевать в среду на основе перевара Хоттингера с дрожжевым и печеночным автолизатом. Отдельные ученые предлагают использовать модифицированную среду ВИЭВ на основе мар­теновского бульона с добавлением сыворотки крови лошади, экстракта дрожжей, глюкозы, лактальбуминагидролизата. В исследуемом материале достаточно часто могут присутствовать другие виды микоплазм, в том чис­ле растущие более быстро, чем M.hyopneumoniae, что затрудняет выделе­ние и идентификацию культур возбудителя. Наиболее эффективно исполь­зование среды Friss с добавлением антисыворотки против M.hyorhinis и циклосерина, что обеспечивает ингибицию роста M.flocullate и M.hyorhinis.

Рекомендуется тканевой материал после измельчения в питательной среде в ступке или гомогенизаторе подвергнуть центрифуги­рованию при 1,5 тыс. об/мин в течение 15 минут, надосадочную жидкость обработать ацетатом таллия и пропустить через стерилизующие фильтры, посеять на среды для микоплазм и с целью контроля на МПА, МПБ, среду Кита-Тароцци. Инкубирование проводить при 37° С до 10 суток с ежед­невным просмотром сред. При отсутствии изменений в среде через 4-6 суток делают до 2-5 «слепых пассажей» с параллельными высевами на плотные среды.

Другие исследователи предлагают следующую апробированную схему бактериологического исследования: тканевый гомогенат (1:10) разводят в среде Friss до 10⁴ и инкубируют при 37° С до трех недель. M.hyopneumoniae лучше растет, если культивирование осуществляется роллерным способом. Посевы просматривают ежедневно на наличие помутнения и изменения рН. В положительных случаях помутнение среды слабое, рН меняется обычно на 5-6-е сутки, при малом содержании возбудителя — позднее. Аналогичные измения на среде Friss без циклосерина и антисыворотки против M.hyorhinis могут вызвать M.flocullate и M.hyorhinis, причем пос­ледний вид растет быстро. Параллельно один миллилитр разведения 10² добавляют к 50 мл среды, пропускают через целлюлозный фильтр с диа­метром пор 0,2 мкм. Затем фильтр помещают в питательную среду, куль­тивируют, отслеживая изменения рН, споласкивают, высушивают и ис­следуют на наличие микроколоний в непрямой реакции иммунофлуоресценции.

При подозрении на инфекцию M.hyorhinis (полиартриты, полисерози­ты) производят посев материала на среду Friss без циклосерина, антисыво­ротки или на другие среды для микоплазм, на большинстве из которых этот вид микоплазм хорошо растет. Из материала делают разведения на среде Friss до 10³-10⁴, инкубируют при 37° С, отслеживая изменения рН, появ­ление помутнения. При наличии бактериальных контаминатов отмечают интенсивное помутнение среды в низких разведениях, закисление или защелочение рН. С целью выявления M.hyosynoviae материал (суставная жид­кость, синовиальные мембраны) измельчают 1:10 и готовят на бульоне для M.hyosynoviae разведения 10³-10⁴. Посевы инкубируют при 37° С с ежедневным контролем. Рост M.hyosynoviae со­провождается слабым помутнением среды или его отсутствием, защелочением рН и образованием пленки, на стенках пробирки формируется мыло-подобный налет. При посеве на агаризованную среду (7% агар Нобеля) большинство штаммов образуют пленки и пятна, а также отложения на колониях «перламутровых кристаллов». Выделе­ние чистых культур M.hyopneumoniae, M.hyorhinis и M.hyosynoviae про­водят по стереотипной схеме.

Идентификация выделенных культур микоплазм. Выделенные чистые культуры микоплазм идентифицируют по сово­купности культуральных, ферментативных признаков, гемагглютинирующей активности. При этом определяют способность микоплазм утили­зировать глюкозу, маннозу, аргинин, разжижать желатин, казеин, сыво­ротку, редуцировать тетразол, образовывать фосфатазу, пленки и пятна при росте на питательных средах, а также агглютинировать эритроци­ты. Характеристики основных видов свиных микоплазм приведены в таблице 94.

При идентификации M.hyopneumoniae в реакции иммунофлуоресцен-ции рекомендуется 2 мл первичной культуры в разве­дении 10¹ пропустить через мембранный фильтр с порами диаметром 0,2 мкм, потом поместить их в среду Friss и инкубировать при 37° С 5-6 дней, что приводит к образованию на фильтрах микроколоний возбудителя, которые идентифицируют непосредственно на мембранных фильтрах следующим об­разом.

Таблица 96 - Дифференциальные признаки свиных микоплазм

Примечание: аэробно/анаэробно, w — слабая реакция, н.д. — нет данных.

Фильтр помещают в стерильный фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,5) и отмывают на магнитной мешалке в течение 10 минут.

Фильтр берут пинцетом и ополаскивают в аналогичном буфере.

Просушивают мембраны на стерильной фильтровальной бумаге, под­писывают, разрезают на 3 части, в соответствии с подписями (1,2,3).

Каждую часть фильтра помещают в лунку планшета; к отдельным частям фильтра добавляют предварительно разведенные сыворотки M.hyopneumoniae, M.flocullate и нормальную кроличью сыворотку, инку­бируют при комнатной температуре в течение 30 минут.

Каждую часть фильтра споласкивают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,5), а затем отмывают в аналогичном растворе на магнитной мешалке в течение 10 минут.

Фрагменты фильтра просушивают на бумаге, вновь помещают раз­дельно в лунки планшета, к каждому сегменту фильтра добавляют рабочее разведение антикроличьей люминесцирующей сыворотки и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут.

Споласкивают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,5), затем отмывают в аналогичном растворе при помощи магнитной мешалки в течение 10 минут.

Подсушивают кусочки фильтра на бумаге, помещают все три фраг­мента на предметное стекло, наносят на них по капле забуференного глице рина, покрывают покровным стеклом и исследуют при помощи люминес­центного микроскопа как при методе эпифлуоресцеиции.

При исследовании антисыворотку M.hyopneumoniae необходимо про­верить на перекрестные реакции с M.flocullate. При обнаружении реагиру­ющих антител проводят адсорбцию сыворотки: 10 мл антисыворотки M.hyopneumoniae смешивают с центрифугатом 100 мл бульонной культу­ры M.flocullate, смесь выдерживают 1 час при 37° С, ночь при 4° С, центри­фугируют, над осадочная жидкость представляет собой адсорбированную иммунную сыворотку.

Обычно идентификацию микоплазм осуществляют методом флуо­ресцентного окрашивания колоний на агаровой среде Friss или на мемб­ранных фильтрах. Тест ингибиции роста также может быть использован для этой цели, но из-за штаммовых антигенных различий результат может быть неоднозначным.

Идентификацию культур M.hyosynoviae осуществляют на основании изучения признаков, а также в тесте инги­биции роста, иммунофлуоресцентного окрашивания колоний на агаровой среде или микроколоний на мембранных фильтрах.

Биопроба. Используют при диагностике инфекции, вызываемой M.hyopneumoniae. Для заражения берут поросят-сосунов или животных 2-3-месячного воз­раста, желательно выращенных без молозива, из хозяйств, благополучных по данной инфекции. В качестве материала для заражения используют надосадочную жидкость легочной суспензии (1:100), обработанную ингиби­торами, провереннную на наличие бактериальных контаминантов, или тка­невый материал предварительно пропускают через мембранные фильтры. Заражение проводят интраназально или трахеально.

Инкубационный период обычно составляет 7-10 суток, диагностичес­кий убой целесообразно проводить через 15-20 суток. Из клинических симптомов наиболее типичен кашель, температурная реакция может быть слабой или совсем отсутствовать. В положительных случаях в легких об­наруживают характерные изменения, подтверждением служит реизоляция культур, наличие серологического ответа.