Выделение и идентификация микоплазм от овец и коз

Культивирова­ние. Исследуемый материал после соответствующей обработки высевают согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике инфекци­онной плевропневмонии коз, инфекционной агалактии овец и коз на среды Эдварда, Мартена, триптический перевар сердца крупного рогатого ско­та. Хороший рост М. agalactiae, M. arginini, M.putrifaciens, M. conjunctivae, микоплазм таксонов 2D, G, U, V, A. oculi, A. laidlavii наблюдается при посе­ве на среду Хейфлик.

Для изоляции микоплазм таксона F-38 посев материала производят на среду Yones и Wood (WYB-cpem), так как этот вид микоплазм отличается повышенной требовательностью к составу среды. При выделении мико­плазм таксона F-38 рекомендуется материал измельчать, но не растирать или гомогенизировать и разводить в бульоне до 10⁴.

С целью выделения М. ovipneumoniae посев производят на модифициро­ванную среду Фрисс с использованием методики разведения, уреаплазм — на среду Ливингстона, Ховарда, Робертсона. М. conjunctivae выделяют посевом на плотную среду Хейфлик.

Посевы инкубируют при 37-38° С в течение 5-7 суток, ежедневно просматривая. При отсутствии роста микоплазм в течение этого срока про­водят пять последовательных пассажей на средах без ингибиторов с интер­валом 5-8 суток. Рост микоплазм на жидких питательных средах проявля­ется опалесценцией, легким помутнением. В случае роста на средах Фрисс, «WJB» микоплазм, расщепляющих глюкозу (М. ovipneumoniae, F-38), на­блюдается изменение цвета среды. При росте уреаплазм на среде Ливингсто­на происходит ее окрашивание в красный цвет (жидкая среда) или формиро­вание окрашенных в соответствующий цвет колоний на плотной среде.

Выделение чистых культур микоплазм и их дифференциацию от
L-форм бак­терий проводят по стереотипной схеме. Морфология колоний микоплазм нa плот­ных средах соответствует типичной, т.е. имеет форму «яичницы-глазуньи». Ис­ключением является М. ovipneumoniae, колонии которой на средах с 1,5-2% агара не образуют врастающего темного центра, что затрудняет, из-за смыва­ния колоний, применение методики эпифлуоресценции для идентификации.

Отличительным культуральным признаком М. putrifaciens является не­характерный для микоплазм гнилостный запах при росте на плотных и жид­ких питательных средах, образование пленки и пятен на яичной среде. Штаммы М. mycoides subsp. mycoides типа LC (козьи штаммы) отличаются от типового штамма М. mycoides subsp. mycoides (тип SC, «коровьи штам­мы») размером колоний. Колонии микоплазм типа LC достигают 1 и более миллимнтров в диаметре (LC — large colony — большие колонии), при 0,5 и менее миллиметров у микоплазм типа SC (SC — sice colony — мелкие колонии). Кроме того, «козьи штаммы» более интенсивно растут в жидких питательных средах, расщепляют казеин, более устойчивы к температуре 45° С, способны к росту на агаре с 5% крови барана или крупного рогатого скота.

Идентификация выделенных культур микоплазм. С целью видовой идентификации изолированных микоплазм, помимо вы­шеописанных культуральных признаков, исследуют ферментативные свой­ства, чувствительность к дигитонину, образование пленок и пятен, наличие уреазы, казеиназы, фосфатазы, способность расщеплять аргинин и диффе­ренцируют по критериям, изложенным в таблице 95.

Таблица 95 - Критерии дифференциации микоплазм, выделяемых
от мелкого рогатого скота (Rosendal S., 1994)

Для серологической идентификации М. agalactiae, M. mycoides subsp. mycoides типа LC, M. mycoides subsp. capri и других микоплазм, изолиро­ванных от овец и коз, при наличии соответствующих антисывороток используют тест ингибиции роста, метод флуоресцирующих антител, РДП и другие серологические реакции. М. mycoides subsp. capri имеет много об­щих признаков с микоплазмами типа LC, но отличается аитигенно. Микоплазмы таксона F-38 проявляют антигенное родство с М. capricolum в РДП, реакции иммунофлуоресценции.

Биопроба. При лабораторной диагностике инфекционной агалактии овец и коз согласно действующей в РФ инструкции биопробу проводят на кроликах (масса 2,5- кг) или, в случае необходимости, на естественно восприимчивых животных (овцы или козы 1--месячного возраста). Животных заражают исследуемым материалом или выделенной культурой микоплазм. Исследуемый материал -гомогенизируют 1:10 в стерильном физиологическом растворе с ингибитора­ми (пенициллин — 1000 ЕД/мл, ацетат таллия —1:2000000), выдержива­ют 1 час при комнатной температуре. При заражении культурой применяют 3--суточную бульонную культуру. Кроликам прокалывают переднюю ка­меру глаза шприцом с тонкой иглой, отсасывают 0,05-0,1мл жидкости и, не вынимая иглы, вводят 0,1-0,2 мл материала. Контролем служит другой глаз, в который вводят 0,1-,2 мл стерильного бульона. Положительный резуль­тат — развитие через 5-2 дней после заражения кератита. Срок наблюде­ния — 30 дней. Овец и коз заражают введением материала в дозе 5 мл подкож­но или в молочный канал или в дозе 2 мл в сустав. Наблюдение за животными проводят в течение 30 суток. Положительный результат — появление клини­ки, характерной для инфекционной агалактии. Больных животных убивают и подвергают бактериологическому исследованию.

Инструкцией по лабораторной диагностике инфекционной плевропнев­монии коз в РФ предусматривается проведение биопробы на 6-2-месяч­ных козлятах. Заражения проводят исследуемым материалом или 3-су-точной бульонной культурой 3-го пассажа. Материал предварительно подвергают обработке ингибиторами (см. выше). Двум козлятам материал в дозе 10 мл вводят внутриплеврально. Наблюдение за животным осуще­ствляют в течение 30 дней. В положительных случаях летальный исход обыч­но наступает через 7-10 суток. На вскрытии обнаруживают характерные патологоанатомические изменения. Трупы животных подвергают бакте­риологическому исследованию.