Выделение и идентификация культуры возбудителя. Культивирование.H.parasuis — факультативный аэроб, температурный оптимум 37-38°С, рН 7,2-7,4

Культивирование. H.parasuis — факультативный аэроб, температурный оптимум 37-38°С, рН 7,2-7,4. На обычных средах возбудитель не растет, требует добавления в среду готового фактора роста — V-фактор (NAD-никотинамидаденин-динуклеотид или NAD-фосфат NADP). В качестве источника V-фактора используют дрожжевой экстракт, энзиматически чистой NAD (NADP), гретую кровь барана (лошади) или растущую культуру «бактерий-кормилок», которая при этом выделяет в окружающую среду V-фактор, что обеспечивает возможность роста вокруг колоний «бактерий-кормилок» сателлитньгх мелких колоний H.parasuis. Стерильные дрожжевой экстракт и чистый NAD добавляют в МПА, МПБ, агар и бульон Хоттингера. Рост H.parasuis также зависит от наличия в среде сыворотки крови (барана, лошади, крупного рогатого скота), которую добавляют в питательную среду в количестве 8-10%. Для первичного выделения возбудителя лучше всего использовать кровяной агар (5- 10% дефибринированной крови барана, лошади, кролика) с «бактерией-кормилкой». При исследовании контаминированного материала применяют среды Controni.

Кровяной агар слегка подсушивают. Исследуемый материал засевай! шпателем (бактериологической петлей) по всей поверхности среды. Затем по диаметру чашки в виде двух прямых линий под углом 90° засевав бактериологической петлей культуру негемолитического штамма стафилококка или Е. coli («бактерия-кормилка»).

На плотные и жидкие питательные среды, содержащие готовые ростовые факторы (NAD, дрожжевой экстракт, гретую кровь), материал засевают обычным способом. Посевы культивируют при 37-38°С в течение 24 - 48 часов в аэробных условиях.

Характер роста Н. parasuis на питательных средах. На кровяном МПА возбудитель растет в виде мельчайших негемолитических колоний на расстоянии не более 1,0-3 см от штриха «бактерии - кормилки» (зона диффузии V-фактора). Вблизи «кормилки» колонии возбудителя крупнее, по мере удаления — мельче, так как снижается концентрация ростового фактора. Такой рост H.parasuis на кровяном агаре называют «сателлитным».

На прозрачном сывороточном МПА с «бактерией-кормилкой» колонии прозрачные, круглые, выпуклые, с ровными краями, слизистой консистенции, флуоресцирующие в косопроходящем пучке света.

На агаре с гретой кровью («шоколадный агар») в первичных посети можно наблюдать колонии двух типов: крупные — диаметр 1,5-2,5 мм и мелкие 0,2-0,5 мм. Морфология колоний лучше различима на прозрачных питательных средах типа агара Левинталя, сывороточно-дрожжевого агара. Колонии на этих средах имеют правильную круглую форму. Они выпук­лые, с гладкой поверхностью, ровными краями, слизистой консистенции, прозрачные, флуоресцирующие в косопроходящем свете. В процессе пассажирования возбудителя на питательных средах в результате диссоциации колонии могут терять свойство флуоресценции.

В жидких питательных средах (бульон Левинталя, сывороточно-дрожжевой бульон) Н. parasuis растет с легким равномерным помутнением среды, через 48-72 часа среда просветляется, на дне пробирки формируется слизистый осадок.

Морфология клеток возбудителя в культуре. Из выросших культур готовят и микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, нa капсулы — по Гинсу, препарат «раздавленная капля» для определения подвижности.

Морфология клеток H.parasuis такая же, как и в патологическом мате-шк, но часто обнаруживаются нитевидные формы. Клетки имеют капсулу, не образуют жгутики.

Идентификация H.parasuis на уровне рода. С целью отнесения выделенной культуры к роду Haemophilus, в первую очередь определяют морфологические, тинкториальные, культуральные признакаки и зависимость роста от NAD, а также подвижность, способность расти на средах с 0,5% NaCI, агаре Мак-Конки, образовывать каталазу, оксидазу, фосфатазу, ферментировать глюкозу, дульцит, гидролизовать твин-80. На практике идентификацию возбудителя, исходя из патолого-анатомических данных, сразу ведут на видовом уровне, придавая первостепенное значение определению NAD-зависимости.

Идентификация H.parasuis на видовом уровне. При видовой идентификации, исходя из происхождения исследуемого материала (свинья), Н. parasuis приходится дифференцировать от NAD-зависимых культур Actinobacillus pleuropneumoniae.

Биопроба. Для определения патогенных свойств вьделенной культуры используют внутрибрюшинный способ заражения морских свинок. Исследуемую культуру выращивают 24 часа на «шоколадном агаре», смывают стерильным физиологическим раствором, устанавливают концентрацию бактерий по оптическому стандарту мутности на уровне 20 ед. Взвесь в дозе 1 мл вводят трем морским свинкам внутрибрюшинно. Гибель в течение 5 суток хотя бы части животных, выявление у погибших морских свинок поражения серозных оболочек и выделение в результате бактериологического исследования исходной культуры позволяют рассматривать ее как вирулентную.

Таблица 74 - Критерии дифференциации Н. parasuis и