Выделение и идентификация коринебактерии

Культивирование. Коринебактерии — факультативные анаэробы, температурный оптимум 37-38° С, рН питательных сред 7,4-7,6. Для выделения патогенных ко­ринебактерии используют кровяной, сывороточный (5%) МПА, МПБ, бу­льон и агар Хоттингера, кровяную теллуритовую среду, среду Леффлера. Контаминированный материал для подавления роста грамотрицательных бактерий засевают на агар Мак-Конки. Посевы инкубируют в условиях обычной атмосферы 24-48 часов.

Особенности роста коринебактерии на питательных средах. С.pseudotuberculosis на кровяном агаре через сутки инкубирования фор­мирует желто-белые или белые с матовой поверхностью, непрозрачные ко­лонии диаметром около 1 мм. Через 48-72 часа культивирования проявля­ется узкая зона гемолиза (у большинства штаммов). При длительном инку­бировании размер колоний может достигать 3 мм, они приобретают корич­неватый цвет и крошковидный характер.

На среде Леффлера возбудитель растет в виде крошковатого с желтым оттенком налета, без разжижения сыворотки. На кровяной теллуритовой среде колонии мелкие, слабовыпуклые, с матовой поверхностью, черного цвета. В питательном бульоне возбудитель растет без или с равномерным помутнением среды, с появлением небольшой пленки и осадка.

C.renale через 24 часа инкубирования образует мелкие, негемолитичес­кие колонии, с возрастом превращающиеся в непрозрачные, белые. C.pilosum образует колонии, сходные с колониями C.renale, приобретаю­щие с возрастом цвет от желтого до коричневого. C.cystitidis формирует колонии как и C.renale, но обычно белого цвета. C.equi (R.equi) через 24 часа выращивания посевов образует мелкие, гладкие, блестящие колонии, негемолитические. В более старых культурах колонии желтовато-розово­го цвета.

Морфология клеток коринебактерии в культуре. Из подозрительных колоний готовят и микроскопируют мазки, окрашен­ные по Граму. Клетки коринебактерии в мазках из колоний по морфологии и тинкториальным свойствам в основном не отличаются от таковых в пре­паратах из исходного материала.

Идентификация коринебактерии на уровне рода. Культуры бактерий, сходные по морфологическим, тинкториальным, культуральным свойствам с коринебактериями, отвивают на питательные среды и исследуют с целью идентификации. Для идентификации на родо­вом уровне принимают во внимание происхождение материала, тинктори-альные особенности (быстрота обесцвечивания при окраске по Граму), мор­фологию клеток, отношение к кислороду, подвижность, каталазную ак­тивность.

Идентификация коринебактерии на уровне вида. Выделенные культуры на последующем этапе дифференцируют на виды путем изучения гемолитической активности на кровяном агаре, фермента­тивных свойств: гидролиз эскулина, редукция нитратов, разжижение жела­тины, образование уреазы, образование кислоты без газа из глюкозы, маль­тозы, сахарозы (табл. 61).

С целью дифференциации коринебактерии «ренальной» группы допол­нительно изучают скорость формирования колоний, цвет, рост при рН 5,4 (в бульоне), редукцию нитратов, разжижение желатина, гидролиз твина-80, образование кислоты из ксилозы, крахмала (табл. 62).

С целью уточнения видовой принадлежности выделенной культуры ко­ринебактерии число изучаемых признаков может быть в случае необходи­мости расширено (табл. 63).

Биопроба. При заражении мышей культурами С. pseudotuberculosis выявляется вариа­бельность их вирулентности. При внутривенном заражении погибает 90,7% животных, при подкожном — около 21,2%. В результате внутрибрюшинного заражения морских свинок (самцы) можно вызвать орхит.

Питательные среды. Среда Тинсдаля. К 1000 мл расплавленного и охлажденного до 50° С 2%-ного МПА добавляют 120 мл 1%-ного раствора L-цистина на 0,1 N хлористоводородной кислоте, 120 мл 0,1 N раствора гидроокиси на­трия, 18 мл 2%-ного раствора теллурита калия, 18 мл 2,5%-ного ра­створа гипосульфата натрия и 200 мл стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота.

Приготовление раствора теллурита калия. В 100 мл дистиллирован­ной воды растворяют 2 г теллурита калия. Раствор стерилизуют в кипя­щей водяной бане 30 минут и хранят при комнатной температуре. В слу­чае выпадения осадка раствор вновь прогревают в водяной бане.

Таблица 61 - Дифференциальные признаки грамположительных,
не образующих спор, неправильной формы палочек

Таблица 62 - Дифференциация коринебактерий и Rhodococcus equi

+ положительная реакция; - отрицательная реакция; v - варьирующий признак;

v"- штаммы, выделенные от лошадей позитивные, от овец - негативные.

Таблица 63 - Дифференциация С. renale, C. pilosum, C. cystitidis

Таблица 64 - Дифференциальные признаки видов коринебактерий

' Исключение — тип ulcerans; ² около 50% штаммов положительны; ³ тип ulcerans может быть отрицательным; ⁴ некоторые штаммы отрицательные; ⁵ некоторые штаммы положительные; нд — нет данных; х — 11-89% штам­мов положительные.

Приготовление раствора гипосульфита натрия. Раствор готовят на стерильной дистиллированной воде. После добавления каждого ком­понента среду тщательно перемешивают и, не стерилизуя, разливают по чашкам Петри. До использования среду можно хранить при 10° С не более 3-4 суток.

Среда предназначена для дифференциации возбудителя дифтерии и дифтероидов. Коринебактерии дифтерии образуют колонии черного цвета, т.к. способны продуцировать сероводород из цистина, взаимодействующий с солью теллурита. С. diphtheriae var. gravis на этой среде образует мелкие, выпуклые, блестящие, черные колонии. Среда обладает селективными свой­ствами, посторонняя микрофлора растет слабо.

Теллуровая среда Клауберга II. К 1000 мл рас­плавленного 3%-ного питательного агара прибавляют 3 мл 2%-ного ра­створа теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл «лаковой кро­ви». Среду разливают в чашки Петри (используют не более 3-4 суток) и хранят при 4-10° С. Коринебактерии дифтерии типа «gravis» образуют серовато-черные колонии с несколько изрезанными краями, типа «mitis» — мелкие, с ровными краями серовато-черные блестящие колонии.

Приготовление «лаковой крови». К 3 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови крупного рогатого ско­та, добавляют 20 мл химически чистого стерильного глицерина. Смесь вы­держивают в холодильнике 3-6 недель.

Кровяной теллуровый агар. К 100 мл рас­плавленного и охлажденного до 45-50° С питательного агара (рН 7,6-7,8) добавляют 10 мл дефибринированной крови лошади или крупного ро­гатого скота, 2 мл 2%-ного раствора теллурита калия (К,ТеО₃). Получен­ную среду перемешивают и разливают в чашки Петри. Колонии дифтерийных бактерий на этой среде имеют черный цвет или черный центр колонии, дифтероидов — более выпуклые, влажные, серого цвета, с коричневым центром, ложнодифтерийных бактерий — мелкие се­рые, с коричневым центром, непрозрачные.

Среда Пергола. Используют как среду обогащения для выделения коринебактерии дифтерии. Из куриного яйца стерильно извлекают желток, переносят его в колбу с бусами и добавляют 100 мл стерильной сыворотки крови лошади или круп­ного рогатого скота, 1 мл 2%-ного раствора теллурита калия; тщательно перемешивают. Полученую смесь разливают по 2-3 мл в стерильные про­бирки и прогревают 1 ч в водяной бане при 56° С. Затем для контроля сте­рильности выдерживают 48 ч в термостате при 37° С. На этой среде дифте­рийные бактерии формируют через 12-
15 ч инкубирования светло- или темно-серые влажные колонии.

Жидкая среда для дифтерийных микробов. К 400 мл сте­рильного бульона (рН 7,6), содержащего 10% сыворотки лошади или крупного рогатого скота, добавляют 75 мл «лаковой крови», 20 мл 1%-ного раствора теллурита калия, 12,5 мл глицериновой смеси и 12,5 мл 1%-ного цистина.

Ацетатно-теллуритовый бульон для дифтерийных микробов. В колбе смешивают 200 мл МПБ (рН 7,4), 2 мл глицерина, 18 мл 50%-ного раствора пептона Витте и 0,63 мл 50%-ного раствора ацетата натрия. Среду стерилизуют текучим паром в течение 1 ч, охлаждают до 48° С и добавляют 10 мл 1%-ного раствора теллурита калия и 21 мл дефибриниро­ванной крови барана.

Желточно-молочно-агаровая среда. К 1000 мл 4%-ного агара на мартеновском бульоне или МПБ (рН 7,6-7,8) добавляют 10 куриных желтков, эмульгируют и вносят 800 мл обезжирен­ного, стерильного молока. Компоненты перемешивают, готовую среду раз­ливают по стерильным пробиркам, скашивают и дважды по 1 ч прогревают в аппарате Коха при 80° С.

Среда Пай. В колбе смешивают 1000 мл содержимого куриных яиц и 500 мл дистиллированной воды, взбивают, фильтруют через двойной слой марли, добавляют 120 мл глицерина, 5 г декстрозы, перемешивают, разли­вают по стерильным пробиркам, скашивают и стерилизуют как свернутую сыворотку (см. среда Леффлера).

Индикаторная среда III для дифтерийных бактерий. К 420 мл 3%-ного питательного агара добавляют 12,5 мл 1%-ного ра­створа цистина, 1,5 мл 50%-ного раствора ацетата натрия, 880 мл 1%-ного раствора теллурита калия. Устанавливают рН 8,0 и вносят 60 мл 2%-ного раствора индикатора водного голубого. В нагретую до 50-55° С среду добавляют смесь следующего состава: 280 мл дистиллиро­ванной воды, 21 мл глицериновой смеси (см.среда Клауберга II), 15 г глюкозы, 140 мл дефибринированной крови (рН смеси 7,0). После пере­мешивания среду разливают в чашки Петри.

Сывороточная среда Леффлера. Рекомендуется для выращивания пато­генных нейссерий, коринебактерии. Смешивают 750 мл сыворотки крови овцы, 250 мл МПБ (рН 7,0), 2,5 г декстрозы, 1,25 г натрия хлорида. Среду разливают в пробирки и свертывают в скошенном положении при 80° С 3 дня по 2ч в аппарате Коха или в сушильном шкафу при 70° С 3 дня по 1 ч.