Обнаружение токсина, выделение и идентификация культуры C. tetani

Обнаружение токсина в исследуемом материале. Исследуемый материал растирают со стерильным песком в ступе с фи­зиологическим раствором (1:2). Половину взвеси экстрагируют при ком­натной температуре в течение часа, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтратом заражают подкожно в заднюю лапку 2 белых мышей (масса 16-18 г) в дозе 0,5-1 мл. Второй группе мышей вводят 0,5 мл фильтрата и 500 ED столбнячного антитоксина. Животным третьей груп­пы вводят фильтрат, прогретый при 100° С в течение 30 минут. Положи­тельный результат: у мышей 2 и 3-й групп изменения должны отсутство­вать, у мышей 1-й группы через 2-4 суток в положительных случаях по­являются признаки тетанического сокращения мышц. Животные погиба­ют с вытянутыми лапками, искривлением позвоночника в сторону лапки, в которую был введен исследуемый материал. За животными наблюдают в течение 10 суток. При выявлении токсина в материале работу по выде­лению культуры прекращают. В соответствии с «Методическими указа­ниями по лабораторной диагностики столбняка» (1983) предусмотрено заражение мышей фильтратом подкожно в заднюю лапку в дозе 0,5-1 мл или двух морских свинок массой 300-350 г в дозе 3-5 мл без предвари­тельного прогревания фильтрата и без введения столбнячного антитокси­на. Срок наблюдения за клиническим состоянием животных — 10 суток.

Выделение культуры C. tetani. Возбудитель — строгий анаэроб, температурный оптимум — 37-38° С, рН 7,2 -7,4.Вторую половину исследуемой взвеси (см. выше) прогревают в течение 20 минут при 80° С, затем засевают в среду Кита-Тароцци с 0,5% глюкозы, печеночный, мартеновский бульон со слоем вазелинового масла. Можно де­лать посев непрогретого материала в два культуральных сосуда, один из кото­рых затем прогревают при 80° С в течение 20 минут. Параллельно прогретый материал высевают с целью получения изолированных колоний на кровяной агар с 1,5% и 3% агара в чашки Петри. Посевы культивируют в анаэростате с разрежением воздуха до 4 -5 мм ртутного столба или с заменой воздуха сме­сью Н₂ и СО₂ при 37 -38° С в течение 2-5 суток.

Через 2-4 дня просматривают посевы на плотных и жидких средах. На среде Кита-Тароцци рост возбудителя сопровождается ее интенсивным помутнением с небольшим газообразованием, позднее (2-3 суток) выпадает осадок, среда просветляется, культура имеет запах жженого рога.

На 3%-ном агаре Цейсслера С. tetani формирует круглые, бесцветные или серые колонии с неровными краями (ризоидные), на 1,5%-ном агаре (влажном) наблюдают характерный расползающийся, роящийся рост воз­будителя. Может наблюдаться узкая зона β-гемолиза.

Из жидких питательных сред и подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. В положительных случаях нахо­дят в мазках тонкие грамположительные палочки с терминальными спора­ми, с возрастом клетки становятся грамвариабельными, вплоть до грамотрицательных. Если первичный посев производили только в жидкую пита­тельную среду, то производят посев бульонной культуры на кровяной агар с целью получения изолированных колоний.

При обнаружении в жидких питательных средах бактериальных клеток, ха­рактерных для С. tetani, на 4-6-е сутки инкубирования определяют наличие в культуре токсина путем ее введения белым мышам, как было указано выше.

Основным направлением лабораторного исследования является обна­ружение токсина, к идентификации выделенной культуры прибегают ред­ко. Для C. tetani характерно отсутствие лецитиназы, липазы, казеиназы, возбудитель не образует кислоты из глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы, гидролизирует желатину, индол образует не постоянно. Для це­лей идентификации удобно использовать тест-системы для анаэробов.