Выделение и идентификация культур М. paratuberculosis

Культивирование. Обработка исследуемого материала перед посевом. В качестве исследуемого материала наиболее подходят мезентериальные лимфатические узлы и илеоцекальный клапан, так же исследуют фекалии.

Фекалии (10 см³) растирают в ступке, смешивают 1:10с 5%-ным раствором щавелевой кислоты, встряхивают во флаконе, ставят на 30 минут на водяную баню (37° С), центрифугируют (2500-3000 об/мин) в течение 15 минут. Осадок отмывают стерильным физиологическим раствором. Материал бактериологи­ческой петлей высевают в 5-6 пробирках с питательной средой, содержащей микобактин, а также в среду Левенштейна-Иенсена. Кусочки лимфатических узлов и отдельно соскобы слизистой и подслизистого слоя измельчают ножница­ми в ступках. Материал из лимфатических узлов заливают 3%-ным раствором H,SО₄ в соотношении 1:10, слизистой — 6%-ным Н₂80₄ и выдерживают 10-15 минут. Затем жидкость сливают, материал на 5- 10 минут заливают стериль­ным физиологическим раствором, удаляют жидкость, ткань растирают в неболь­шом объеме физиологического раствора и высевают на питательную среду, как описано выше.

В США принята следующая схема обработки материала перед посе­вом. Лимфатические узлы, илеоцекальный клапан. Ткань лимфатических узлов или мукозу (4 г) заливают 40 мл 0,1% цефирана и встряхивают в тече­ние 30 минут. Взвесь фильтруют через марлю, центрифугируют. Седимент ресуспендируют в 40 мл 0,15%-ного цефирана, отстаивают 20 минут, осторожно удаляют супернатант. В каждую пробирку с выбранной питатель­ной средой высевают 0,1 мл седимента. Фекалии. 1 грамм суспендируют в 40 мл дистиллированной воды, встряхивают 30 минут при комнатной тем­пературе, отстаивают 60 минут. Помещают 5 мл супернатанта в 30 мл дис­тиллированной воды, содержащей 0,3% цефирана. Смесь выдерживают 24-36 часов при комнатной температуре. Супернатант удаляют, седимент вы­севают на питательные среды.

Посевы инкубируют при 37° С в аэробных условиях до 16 недель. При отсутствии роста просматривают еженедельно.

В питательные среды (Данкина, Ренжара) добавляют ростовой фак­тор микобактин (0,3 мг/мл), его можно заменить экстрактами из микобакте­рии других видов, которые вносят в среду в количестве 1-4%. Наибольшее количество ростового фактора содержится в экстрактах из M. phlei.

Для ингибиции роста грибов в среды рекомендуется добавлять амфотерицин «В» до конечной концентрации 5 мкг/мл.

Особенности роста М. paratuberculosis на питательных средах. На оптимальной питательной среде (яичной) в первичных посевах коло­нии формируются через 18-100 дней культивирования.

Колонии мелкие, постепенно их размер достигает 2-4 мм, они бесцвет­ные, плоские с неровными краями и ядром в центре. Позднее колонии приоб­ретают бугристый вид. В субкультурах возбудитель растет быстрее (от 3 не­дель до 2 месяцев). На жидких средах (МПБ с глицерином, синтетические среды) образует на поверхности нежную беловатую пленку, которая через 3-4 месяца утолщается и спускается на дно колбы.

Морфология и тинкториальные свойства М. paratuberculosis в культуре. В препаратах из культур, окрашенных по методу Циля-Нильсена, на­ходят мелкие, кислотоустойчивые (красного цвета) палочковидные клетки шириной около 0,5 и длиной 1 мкм.

Ферментативные свойства возбудителя. М. paratuberculosis не аккумулирует ниацин, не образует уреазу, синтези­рует никотинамидазу, пирозинамидазу, не образует β-галактозидазу, кис­лую фосфатазу, пероксидазу, арилсульфатазу, не редуцирует нитраты.

Патогенные свойства M. paratuberculosis. У лабораторных животных

M. paratuberculosis, в отличие от возбудите­ля туберкулеза, заболевания не вызывает.