Выделение и идентификация культур патогенных эшерихий

Культивирование. Эшерихий — факультативные анаэробы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная температура роста 37- 38° С, рН среды 7,0-7,2, хорошо растут на всех широко используемых в лабораторной практике питательных средах.

Исследуемый материал высевают на плотные селективно-дифференци­альные среды Эндо, или Левина, или Мак-Конки и среду с сорбитом. Посевы инкубируют при 37° С в течение 18-24 часов. По истечении этого сро­ка посевы просматривают и отбирают 10 колоний (5, выросших после посе­ва фекалий или соскобов со слизистой кишечника, и 5 - из других орга­нов, в т.ч. брыжеечных лимфатических узлов), типичных для эшерихий, которые пересевают в МПБ, на МПА и среду Минка (при наличии колоний слизистой консистенции, т.е. тянущихся за петлей, их обязательно отсева­ют на среду Минка) в чашках, разделенных карандашом для стекла на 10 секторов (каждую колонию на 2 среды в отдельный пронумерованный сек­тор). При подозрении или целенаправленном исследовании на отечную бо­лезнь поросят (энтеротоксемию) дополнительно пересевают несколько ко­лоний на кровяной агар в чашке, разделенной на соответствующее количе­ство секторов. С чашек с культурами на среде с сорбитом отсевают 3-4 колонии S-формы серовато-белого цвета в пробирки со скошенным МПА. Культуры, выделенные от птиц, на МПА и среду Минка не пересевают. Их высевают в специальные питательные среды для изучения биохимических свойств.

Характер роста эшерихий на питательных средах. На плотных питательных средах эшерихий образуют круглые с гладкой, вьшуклои поверхностью, ровным краем, диаметром 2-4 мм колонии. На МПА колонии полупрозрачные, сероватого цвета. На средах Эндо, Левина и Мак-Конки за счет ферментации лактозы и закисления среды приобретают цвет индикаторов: на среде Эндо - красные, малиново-красные с металлическим блеском или без него; на среде Левина — темно-синие, фиолетовые, черные с металлическим блеском или без него; на среде Мак-Конки — розовые, крас­ные (отдельные штаммы эшерихий могут не ферментировать лактозу и форми­ровать на перечисленных средах бесцветные колонии). На среде с сорбитом эшерихий серогруппы О157 (варианты О157:Н7 и О157:Н), вызывающие диарею животных с признаками геморрагического гастроэнтерита, образуют серовато-белые колонии S-формы. Колонии эшерихий других серогрупп — красно-малинового цвета. Колонии штаммов, образующих гемолизин, на кро­вяном агаре окружены зоной гемолиза. В МПБ рост эшерихий проявляется в виде равномерного помутнения среды с образованием легко разбивающегося осадка.

Обнаруженные на данном этапе исследований эшерихий с гемолитичес­кими свойствами, выделенные от поросят-отъемышей с признаками отеч­ной болезни (из содержимого тонкого отдела их кишечника и (или) брыже­ечных лимфатических узлов), относят к возбудителю отечной болезни (энтеротоксемии) поросят.

Морфология клеток эшерихий в культуре. Вмазках, приготовленных из культур, эшерихий обнаруживают в виде грамотрицательных, мелких (1,0-3,0x0,3-0,6 мкм) прямых пало­чек с закругленными концами. В поле зрения микроскопа располагаются одиночно, реже попарно. Спор не образуют. Некоторые (штаммы серо групп 08, 09, 020, 0101) образуют капсулу или микрокапсулу. Большин­ство подвижно за счет перетрихиальных жгутиков, но встречаются и не­подвижные.

Идентификация эшерихий по ферментативным признакам. Выделенные чистые культуры микроорганизмов с характерными для эше­рихий культуральными, морфологическими и тинкториальными свойства­ми окончательно относят к роду Escherichia и виду E.coli на основании изучения их ферментативных свойств. Ориентируясь на критерии к E.coli относят штаммы, образующие индол, не образую­щие H₂S, дающие положительную реакцию с метиловым-красным (среда окрашивается в розово-красный цвет) и отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра (среда окрашивается в желтый цвет), не растущие на среде Симмонса, не расщепляющие мочевину, образующие лизиндекарбоксилазу. Большая часть эшерихий образует орнитиндекарбоксилазу, ферменти­рует манит. Все (за редким исключением) сбраживают лактозу.

На данном этапе исследований диагноз на колибактериоз считают установленным в том случае, если выделены чистые культуры Е. coli не менее чем из двух ниже указанных органов и тканей: селезенки, крови, крови сердца, костного мозга, головного мозга свежего трупа животного без изучения па­тогенных свойств штаммов и установления их серогрупповой принадлежно­сти. В остальных случаях устанавливают патогенность выделенных куль­тур.

Серологическая идентификация. Важнейшую информацию о патогенных свойствах эшерихий получают при определении их антигенной структуры. Клетки эшерихий содержат три вида антигенов: О — соматический; К — оболочечный и Н — жгутиковый.

О-антиген термостабилен (выдерживает нагревание при 100° С в тече­ние 2,5 часов). Является липополисахаридо-протеиновым комплексом, не­однороден, и на его основе эшерихий делят на группы (более 160
О-групп).

К-антигены поверхностные, оболочечные (кислые полисахариды, редко протеины). По своим свойствам их подразделяют на три типа:
L-антиген тер­молабильный, инактивируется при 100° С в течение часа;

В-антиген в этих же условиях теряет агглютинабелыюсть; А-антиген термостабильный, инак­тивируется при 120° С в течение 2,5 часов, имеется у слизистых капсулообразующих эшерихий О-групп 08,09,020,0101;
Н-антиген термолабильный, инактивируется при 60° С в течение 1 часа, протеин, располагается в фимбриях (пилях), пронизывающих клеточную стенку, поэтому в последнее время его чаще называют фимбриальным антигеном.

К-антигены покрывают О-антиген и делают клетки эшерихий иннаглютинабельными в гомологичных О-сыворотках. Они обладают адгезивными свой­ствами, т.е. с их помощью бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам кишечника. Адгезивные антигены являются фактором патогенности, который изучается у чистых культур E.coli в первую очередь.

Н-антиген — жгутиковый, состоит из протеина, термолабилен, имеет несколько десятков разновидностей, определяемых в РА. Для диагностики существенного значения не имеет. Сочетание О-, К- и Н-антигенов харак­теризует серологический вариант (серовар) эшерихий.

Ведущая роль в развитии колибактериоза принадлежит эшерихиям с адгезивными антигенами К88, К99, F41, F18, 987Р, А20 и др. Наличие этих адгезинов можно выявить в реакции агглютинации на стекле или в ELISA-тесте с соответствующими антисыворотками. В нашей стране наи­более распространенным методом выявления адгезивных антигенов у эше­рихий является РА. Для этой цели промышленностью выпускается набор агглютинирующих сывороток к адгезивным антигенам эшерихий. Этот набор включает моновалентные агглютинирующие сыворотки к антиге­нам К88, К99, F41, 987Р, А20 и поливалентную агглютинирующую сыво­ротку, представляющую собой смесь моновалентных сывороток в равных объемах. Сыворотки выпускаются в сухом виде во флаконах по 0,5 см³, что обеспечивает сохранение их специфической активности на срок не менее 5-ти лет.

Постановка РА. В ампулу (флакон) с сухой сывороткой добавляют растворитель (ди­стиллированная вода или физиологический раствор) до первоначального объема сыворотки (0,5 см³), затем растворителем разводят поливалентную сыворотку в соотношении 1:2, а моновалентные — 1:10 (рабочий титр). Разведенные сыворотки хранят в пробирках (флаконах) под резиновой проб­кой при температуре 4-10° С до 3 месяцев. По внешнему виду разведен­ные сыворотки должны представлять собой прозрачную или слегка опалесцирующую бледно-розовую жидкость. Мутные сыворотки, проросшие пле­сенью или другими микроорганизмами, с обильным осадком к употребле­нию непригодны.

Для выявления антигенов К88, 987Р и А20 используют культуры эше­рихий, выращенные на МПА или агаре Хоттингера, для обнаружения анти­генов К99 и F41 — на среде Минка. В обоих случаях посевы инкубируют при 37-38° С в течение 20-24 часов.

Культуры эшерихий, выделенные от птиц, для выявления адгезивных антигенов не используют. Выросшие культуры исследуют в РА на стекле вначале с поливален­тной, а затем (в случае положительной реакции) с моновалентными сыво­ротками. С этой целью каплю поливалентной сыворотки наносят на пред­метное стекло, бактериологической петлей берут испытуемую культуру и тщательно растирают с сывороткой. Реакцию учитывают в течение одной минуты при легком покачивании стекла при температуре от 18 до 28° С. Контролем служит испытуемая культура, смешанная с каплей физиологи­ческого раствора (рН 7,2 -7,4) и с каплей нормальной кроличьей сыворот­ки, разведенной 1:10 (для исключения самоагглютинации культуры).

Положительная реакция характеризуется склеиванием микробных кле­ток в зерна или хлопья различной величины и полным или частичным про­светлением сыворотки при отсутствии агглютинации в контроле.

Эшерихии, давшие положительную реакцию агглютинации с одной из сывороток, считают возбудителем колибактериоза (колидиареи).

Наличие адгезивных антигенов у энтеропатогенных эшерихии (ЕРЕС) имеет определенную связь с хозяевами этих возбудителей и
О-серогруппами (табл. 21).

Культуры эшерихии на скошенном МПА, полученные после пере­сева серовато-белых колоний со среды с сорбитом (не ферментирую­щие этот многоатомный спирт), исследуют с агглютинирующей коли-сывороткой О157 в РА на стекле. Реакцию ставят с живыми культура­ми. Для исключения самоагглютинации бактериальных клеток куль­туру исследуют с 0,85%-ным раствором натрия хлорида. При отсут­ствии агглютинации в контроле и ее наличии на стекле с коли-сывороткой О157 исследуемые эшерихии относят к возбудителю колибак­териоза.

Таблица 21 - Распространение адгезивных антигенов у ЕРЕС в