Лабораторная работа. 1. Определение мочевины в сыворотке крови неферментативным методом с диацетилмонооксимом Оборудование: 1. Штатив с пробирками

1. Определение мочевины в сыворотке крови неферментативным методом с диацетилмонооксимом

Принцип метода. Мочевина образует с диацетилмонооксимом в присутствие тиосемикарбазида и солей железа в кислой среде окрашенные соединения, интенсивность окраски которых определяется колориметрически.

Ход работы. В одну пробирку вносят 0,1 мл сыворотки, во вторую – 0,1 мл стандартного раствора мочевины (концентрация – 16,7 ммоль/л). Затем в обе пробирки добавляют по 2,0 мл рабочего раствора для определения мочевины, перемешивают и ставят в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробирки охлаждают в струе холодной воды и колориметрируют при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против воды.

Расчет проводят по обычной формуле.

Нормальное содержание мочевины в сыворотке – 2,5-8,3 ммоль/л.

2. Определение мочевины в сыворотке крови ферментативным методом

Принцип метода. Мочевина под действием уреазы разлагается на СО₂ и NH₃. Образовавшийся аммиак в реакции с салицилатом натрия и гипохлоритом натрия в присутствии нитропруссида натрия образует окрашенное вещество, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации мочевины и измеряется фотометрически.

Ход работы. В три пробирки добавить по 0,5 мл реагента 1 и поставить в термостат при 37^ОС на 5 минут. Вынуть пробирки и добавить реактивы по схеме:

Содержимое пробирок перемешать и поставить в термостат на 5 минут. Через 5 минут достать пробирки и в каждую добавить по 2 мл реагента 2 и по 2 мл реагента 3. Хорошо перемешать и поставить в термостат на 5 минут.

После инкубации измерить оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контрольной пробы при длине волны 640 нм (красный светофильтр) в кювете толщиной 1 см.

Расчет концентрации мочевины проводят по обычной формуле.

Диагностическое значение определения мочевины в сыворотке

Отклонения от нормального содержания мочевины в сыворотке крови зависят от скорости процессов синтеза мочевины и ее выделения.

Увеличение мочевины в сыворотке является одним из главных признаков нарушения функции почек. Из фракций остаточного азота раньше всего повышается уровень мочевины и может достигать более высоких значений по сравнению с другими фракциями остаточного азота. При почечной недостаточности азот мочевины может составлять до 90% всего остаточного азота.

Повышение уровня мочевины сыворотки может носить и непочечный характер: при потере жидкости (обезвоживание, рвота, понос), при усиленном распаде белков (острая желтая атрофия печени, тяжелые заболевания).

Уменьшение содержания мочевины может наблюдаться при заболеваниях печени (паренхиматозная желтуха, цирроз печени) из-за нарушения синтеза мочевины.

3. Определение креатинина в сыворотке крови

Принцип метода. В щелочной среде креатинин реагирует с пикриновой кислотой, образуя оранжево-красные соединения, интенсивность окраски которых определяют колориметрически.

Ход работы. В четырех пробирках смешать реактивы по схеме:

Через 5 минут содержимое пробирки №1 перенести в центрифужную пробирку и центрифугировать при 3000 об/мин в течение 5 минут. 1мл надосадочной жидкости внести в чистую пробирку (будет №1). В каждую пробу (пробирки № 1, 2, 3, 4) добавить по 0,5 мл пикриновой кислоты и по 0,5 мл едкого натра. Перемешать и оставить на 20 минут при комнатной температуре. Колориметрирование проводить против контрольной пробы при зеленом светофильтре в кюветах толщиной 0,5см.

Расчет концентрации креатинина проводят по обычной формуле. Для мочи полученный результат умножают на 50 (коэффициент пересчета).

Содержание креатинина в суточной моче определяют по формуле:

С х 1,5/1000 = ммоль/сутки, где

С – концентрация креатинина в моче в мкмоль/л, 1,5 – суточный диурез в литрах, 1000 – коэффициент перевода мкмоль в ммоль.

Норма креатинина в сыворотке крови – 53-106 мкмоль/л, в суточной моче – 4,4-17,6 ммоль/сутки.

Клиренс (коэффициент очищения) по креатинину рассчитывают по формуле:

(креатинин в моче/креатинин в крови) х 1,07, где

1,07 – минутный диурез.

В норме клиренс по креатинину – 80-120 мл/мин.

Диагностическое значение определения креатинина

Определение креатинина проводят для исследования функции почек. Содержание его в сыворотке крови увеличивается при значительном ухудшении функции почек. Креатининемия наблюдается также при закупорке мочевых путей, кишечной непроходимости, тяжелом диабете, механической желтухе, гиперфункции надпочечников, голодании. Увеличение креатинина в моче наблюдается при усиленной мышечной работе, лихорадочных состояниях, пневмонии, выраженной недостаточной функции печени.

Понижение креатинина в моче – при мышечной атрофии, голодании, дегенерации почек, лейкемии.

Расчет клиренса креатинина позволяет получить информацию об интенсивности основных функций нефронофильтрации, реабсорбции, секреции и почечном кровообращении.

Проверка качества усвоения знаний (конечный уровень)

а) Вопросы для защиты лабораторной работы