Этапы изготовления гистопрепаратов и техника микроскопирования

Подготовка гистологического материала и

приготовление парафиновых срезов

1. Фиксировать небольшие (0,5 х 0,5 х 1,0 см) кусочки органов в 10% водном растворе формалина (или жидкости Буэна: 15 объемов насыщенного водного раствора пикриновой кислоты + 5 объемов формалина + 1 объем ледяной уксусной кислоты) – 24 часа. (Величина кусочка не должна превышать указанную, так как фиксатор за сутки проникает на глубину не более 0,2 см. Объем фиксатора должен превышать объем кусочка в 30-50 раз).
2. Промыть кусочки в проточной воде – 24 часа.
3. Обезводить кусочки (и частично уплотнить) в спиртах возрастающей крепости – 70⁰, 80⁰, 90⁰, 96⁰ и 100⁰ (в зависимости от характера материала от 6 до 24 часов).
4. Выдержать в ксилоле – 2 часа (в хлороформе – 24 часа) – это связано с тем, что парафин не соединяется со спиртом.
5. Выдержать в насыщенном растворе ксилола (или хлороформа) с парафином при температуре 37⁰ С (в термостате) – 2 часа (можно до суток), чтобы избежать большого перепада температур.
6. Выдержать в чистом парафине (или содержащем до 5 % пчелиного воска) при температуре 56-60⁰ С.
7. Залить материал парафином в бумажных или металлических формочках. Охладить в воде.
8. Вырезать кусочки и наклеить на деревянные кубики.
9. Изготовить тонкие (5-6 мкм) срезы на микротоме (санном или роторном).
10. Поместить срезы на предметные стекла, смазанные яичным белком с глицерином.
11. Расправить срезы на капле дистиллированной воды при легком подогревании.
12. Подсушить срезы в термостате при температуре 37⁰ С.

Окрашивание срезов гематоксилин-эозином

1. Депарафинировать в ксилоле – 2 мин.
2. Удалить ксилол 96⁰ спиртом – 2 мин. Затем стекло со срезами поместить в дистиллированную воду – 2 мин (можно дольше).
3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-3 мин.
4. Срез поместить в водопроводную воду на 5-10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше «вызреет» и окраска будет лучше).
5. Срез ополоснуть дистиллированной водой и нанести каплю раствора эозина – 1 мин.
6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5-1 мин в каждой.
7. Обезводить в двух порциях 96⁰ спирта по 1 мин в каждом (лучше капать из капельницы).
8. Окончательно обезводить в 100⁰ спирте или карболксилоле – 1 мин.
9. Просветлить срез ксилолом – 2 мин.
10. Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.

После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.

Помимо этого классического и наиболее широко распространенного метода существует большое количество других методов для выявления различных клеточных и тканевых структур, а также цито- и гистохимические методы.

Техника микроскопирования гистологических препаратов приведена выше.

Таблица 2